中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (12): 1402-1406
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刘芬, 李勇, 赵宁, 李东海, 江榕, 曾振国, 邵强, 彭菲菲, 王燕, 钱克俭. MicroRNA-132增强乙酰胆碱对肺泡巨噬细胞炎症反应的抑制作用[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(12): 1402-1406.
Liu Fen, Li Yong, Zhao Ning, Li Donghai, Jiang Rong, Zeng Zhenguo, Shao Qiang, Peng Feifei, Wang Yan, Qian Kejian. MicroRNA-132 enhances acetylcholine-mediated inhibitory effect on lipopolysaccharide induced inflammatory response of alveolar macrophages[J]. Chin J Emerg Med, 2015, 24(12): 1402-1406.
MicroRNA-132增强乙酰胆碱对肺泡巨噬细胞炎症反应的抑制作用
刘芬, 李勇, 赵宁, 李东海, 江榕, 曾振国, 邵强, 彭菲菲, 王燕, 钱克俭     
330006 南昌，南昌大学第一附属医院重症医学科(刘芬、赵宁、江榕、曾振国、邵强、彭菲菲、王燕、钱克俭)；
南昌大学第一附属医院肿瘤科(李勇)；
南昌大学第一附属医院神经外科(李东海)
收稿日期：2015-04-18
基金项目：国家自然科学基金(81101410，81460292)；江西省自然科学基金(20122BAB205002) 作者单位：330006
通信作者：钱克俭，Email：qiankejianicu@163.com
摘要：目的 观察调控microRNA-132(miR-132)联合乙酰胆碱(ACh)对脂多糖 (LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的作用。 方法 分别采用FAM荧光标记的mimic/ inhibitor阴性对照(NC)、miR-132 mimic/ inhibitor、mimic/ inhibitor NC转染大鼠肺泡巨噬细胞NR8383，通过荧光显微镜观察转染效率，实时荧光定量PCR检测miR-132的表达。转染后细胞给予LPS(1 μg/mL)刺激或LPS+ACh(10 μmol/L)处理，采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-6(IL-6) 浓度。两组间均数比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。 结果 通过在NR8383细胞中转染mimic FAM NC确定50 nmol/L为转染mimic的最佳浓度。与mimic NC组相比，miR-132 mimic组细胞中miR-132 的表达上调了(21.54± 2.14)倍(P=0.001)。LPS组中结果发现miR-132 mimic上清液中TNF-α(P=0.683)、IL-1β(P=0.770)、IL-6(P=0.872)水平较mimic NC差异均无统计学意义；LPS+ACh+mimic NC组TNF-α(P=0.008)、IL-1β(P=0.004)、IL-6(P=0.003)水平与LPS+mimic NC组相比均下降；LPS+ACh+miR-132 mimic组TNF-α(P=0.001)、IL-1β(P=0.001)、IL-6(P=0.001)水平与LPS+ACh+mimic NC组相比均下降。通过转染inhibitor FAM NC确定100 nmol/L为转染inhibitor的最佳浓度。LPS组miR-132 inhibitor上清液中TNF-α(P=0.800)、IL-1β(P=0.449)、IL-6(P=0.418)水平较inhibitor NC差异均无统计学意义。LPS+ACh组结果显示miR-132 inhibitor可逆转ACh介导的TNF-α(P=0.018)、IL-1β(P=0.022)、IL-6(P=0.032)水平的下降。 结论 在体外培养环境，单独给予LPS时过表达miR-132或抑制miR-132活性不影响肺泡巨噬细胞炎症反应，但miR-132可增强ACh对LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应的抑制作用。
关键词： MiR-132     乙酰胆碱     脂多糖     转染    肺泡巨噬细胞    炎症反应    肿瘤坏死因子-α    白细胞介素-1β    白细胞介素-6    
MicroRNA-132 enhances acetylcholine-mediated inhibitory effect on lipopolysaccharide induced inflammatory response of alveolar macrophages
Liu Fen, Li Yong, Zhao Ning, Li Donghai, Jiang Rong, Zeng Zhenguo, Shao Qiang, Peng Feifei, Wang Yan, Qian Kejian     
Department of Critical Care Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
Corresponding author: Qian Kejian, Email: qiankejianicu@163.com
Abstract:Objective To observe the effects of microRNA-132 (miR-132) combined with acetylcholine (ACh) on the lipopolysaccharide (LPS) induced inflammatory response in rat alveolar macrophages. Methods NR8383 cells were transfected with fluorescein amidite (FAM) - labeled mimic/ inhibitor negative control (NC), miR-132 mimic/ inhibitor, or mimic/ inhibitor NC. Transfection efficiency was observed by fluorescence microscope. The expression of miR-132 was detected by real time fluorescence quantitative PCR. The cells were treated with LPS (1 μg/mL) or LPS+ACh (10 μmol/L) after transfection. The concentrations of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in the supernatant of cell culture were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Comparisons between two groups were done by using Student ttest, and difference was statistically significant with P< 0.05. Results Alevel of 50 nmol/L of mimic FAM NC was established as an optimal concentration for mimic transfecting NR8383 cells. The expression of miR-132 in the miR-132 mimic group was up-regulated (21.54 ± 2.14) folds compared with the NC group (P=0.001). In LPS group, there were no significant differences in the levels of TNF-α (P=0.683), IL-1β (P=0.770) and IL-6 (P=0.872) in the culture supernatant between miR-132 mimic-transfected and mimic NC-transfected alveolar macrophages. The levels of TNF-α (P=0.008), IL-1β (P=0.004) and IL-6 (P=0.003) in the LPS+ACh+mimic NC group were lower compared with the LPS+mimic NC group. The levels of TNF-α (P=0.001), IL-1β (P=0.001) and IL-6 (P=0.001) in the LPS+ACh+miR-132 mimic group were lower compared with the LPS+ACh+mimic NC group. Alevel of 100 nmol/L of inhibitor FAM NC was established as an optimal concentration for inhibitor transfection of cells. In LPS group, there were no significant differences in the levels of TNF-α (P=0.800), IL-1β (P=0.449) and IL-6 (P=0.418) in the supernatant of cell culture between miR-132 inhibitor-transfected cells and inhibitor NC-transfected cells. The levels of TNF-α (P=0.018), IL-1β (P=0.022) and IL-6 (P=0.032) decreased mediated by Ach could be reversed in the LPS+ACh+miR-132 inhibitor group. Conclusions In vitro culture environment, neither excessive expression of miR-132 nor inhibition of miR-132 influenced the inflammatory response of alveolar macrophages treated with LPS alone, but miR-132 can enhance ACh-mediated inhibitory effect on inflammatory response of LPS induced alveolar macrophages.
Key words: MiR-132     Acetylcholine     Lipopolysaccharide     Transfection     Alveolar macrophage     Inflammatory response     TNF-α     IL-1β     IL-6    

肺泡巨噬细胞炎症因子失控性释放是引发脓毒症肺损伤的重要原因之一[1, 2]。近年来越来越多的研究发现microRNAs参与了脓毒症炎症反应的免疫调控，如miR-146a、miR-155、miR-125b、miR-21等[3, 4, 5, 6, 7]。笔者的前期研究[8]发现在脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞中，miR-132的表达随LPS刺激时间延长而逐步上调，提示miR-132可能参与了肺泡巨噬细胞炎症反应的调控。有研究[9]在小鼠巨噬细胞 RAW 264.7及体内实验中发现miR-132可靶向作用乙酰胆碱酯酶(AChE)mRNA，降低AChE的表达从而可减少对神经递质乙酰胆碱(ACh)的水解，而ACh是机体胆碱能抗炎通路的重要组成部分，ACh可与巨噬细胞表面α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)结合，抑制炎症因子的释放[10]。但miR-132通过调控胆碱能抗炎通路对肺泡巨噬细胞炎症反应的作用未见报道。本研究在大鼠肺泡巨噬细胞中转染miR-132 mimic及miR-132 inhibitor，观察过表达miR-132及抑制其活性对LPS诱导的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-6(IL-6)的影响；由于ACh由迷走神经分泌，在体外细胞培养环境中缺乏，因此我们在肺泡巨噬细胞上清液中加入外源性ACh，分别观察过表达miR-132及抑制miR-132活性联合ACh对LPS诱导的炎症因子的影响，为阐明miR-132调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

NR8383大鼠肺泡巨噬细胞(中国科学院细胞库)；Ham’ s F-12K培养基(美国Sigma-Aldrich)；胎牛血清(美国Gibco)；miR-132 mimic/ inhibitor、mimic/ inhibitor阴性对照(mimic/ inhibitor NC)、mimic/ inhibitor FAM荧光阴性对照(mimic/ inhibitor FAM NC)(美国Invitrogen)；PowerFect siRNA转染试剂(美国SignaGen)；LPS(美国Sigma-Aldrich)；ACh(美国Sigma-Aldrich)；PrimeScript 逆转录试剂盒(大连TaKaRa)；SYBR实时荧光定量试剂盒(大连TaKaRa)；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(上海森雄)。

1.2 细胞培养

使用去致热源处理的耗材培养NR8383细胞，将细胞培养于含15%胎牛血清的Ham’ s F-12K培养基，置于含5% CO2的37 ℃恒温湿培养箱中。每2～3 d换液一次，细胞生长融合至80%以上时进行传代。

1.3 细胞转染

取对数生长期的NR8383细胞在转染前24 h按0.5×106个/孔接种至6孔板。按照PowerFect siRNA 转染试剂说明书，将不同浓度的mimic/ inhibitor FAM NC转染至细胞，5 h后通过荧光显微镜检测转染效率，确定最佳转染浓度。按照最佳转染浓度将miR-132 mimic/ inhibitor、mimic/ inhibitor NC分别转染至各组细胞，转染24h后通过实时定量PCR(RT-qPCR)检测mimic组细胞中miR-132的相对表达量。

1.4 实验分组及处理

将NR8383细胞分为miR-132 mimic/ inhibitor组、 mimic/ inhibitor NC组、LPS+miR-132 mimic/ inhibitor组、LPS+mimic/ inhibitor NC组、LPS+ACh+miR-132 mimic/ inhibitor组、LPS+ACh+mimic/ inhibitor NC组。细胞转染24 h后，LPS组给予浓度1 μg/mL的LPS刺激，LPS+ACh组在LPS刺激前5 min给予浓度10 μmol/L的ACh处理。刺激12 h后收集各组细胞上清液，用于检测TNF-α、IL-1β、IL-6 浓度。

1.5 NR8383细胞中miR-132相对表达量的检测

采用RT-qPCR检测各组细胞中miR-132的相对表达量变化。首先采用TRIzol法提取NR8383细胞总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测总RNA完整性及浓度。按照PrimeScript 逆转录试剂盒说明书操作，将RNA逆转录成cDNA，采用10 μL反应体系。miR-132逆转录引物：5’-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC GAC CA-3’；U6逆转录引物：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。按照SYBR 实时荧光定量试剂盒说明书在ABI StepOne定量PCR仪上进行扩增，采用20 μL反应体系，miR-132 PCR正向引物：5’-GCC GCT AAC AGT CTA CAG CCA T-3’，miR-132 PCR逆向引物：5’-GTG CAG GGT CCG AGG T-3’；U6 PCR正向引物：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，U6 PCR逆向引物：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。采用2-ΔΔCt 方法计算miR-132的相对表达量。

1.6 NR8383细胞上清液中炎症因子浓度的检测

采用ELISA测定各组NR8383细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的浓度，按照试剂盒说明书进行检测，在450 nm处检测吸光度。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间均数比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 过表达miR-132联合ACh对肺泡巨噬细胞炎症反应的影响

首先采用20 nmol/L、50 nmol/L带有FAM荧光标记的mimic FAM NC转染NR8383细胞，结果发现50 nmol/L组可见大量细胞呈现绿色荧光(见图 1A)，因此确定50 nmol/L为转染mimic的最佳浓度。随后采用50 nmol/L的miR-132 mimic转染NR8383细胞，转染24室h后RT-qRCR结果显示miR-132 mimic组细胞中miR-132 的表达较mimic NC组上调了(21.54± 2.14)倍(t=-16.633，P=0.001)(见图 1B)。

mimic FAM NC：mimic FAM荧光阴性对照；mimic NC：mimic阴性对照；LPS：脂多糖；ACh：乙酰胆碱；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6 ；NS：差异无统计学意义；a P＜0.05； n=3 图 1 过表达miR-132联合ACh对肺泡巨噬细胞炎症反应的影响 Fig 1 Effect of overexpression of miR-132 combined with ACh on alveolar macrophage inflammatory
图选项

在NR8383细胞中通过miR-132 mimic成功过表达miR-132后，给予1 μg/mL的LPS刺激12 h，结果发现上清液中TNF-α(t=0.439，P=0.683)、IL-1β(t=0.313，P=0.770)、IL-6(t=0.171，P=0.872)的水平较mimic NC差异均无统计学意义(见图 1C-E)。当在LPS刺激前预先给予10 μmol/L的ACh处理，结果发现：LPS+ACh+mimic NC组的TNF-α、IL-1β、IL-6水平与LPS+mimic NC组的相比均下降[TNF-α(pg/mL)：467.09±32.64 vs. 655.43±57.58，t=-4.929，P=0.008；IL-1β(pg/mL)：255.82±16.18 vs. 383.64±32.71，t=-6.068，P=0.004；IL-6(pg/mL)：352.82±28.84 vs. 585.10±53.58，t=-6.611，P=0.003]，提示ACh对肺泡巨噬细胞炎症反应具有抗炎作用；LPS+ACh+miR-132 mimic组的TNF-α、IL-1β、IL-6水平与LPS+ACh+mimic NC组的相比均下降[TNF-α(pg/mL)：137.57±38.05 vs. 467.09±32.64，t=11.386，P=0.001；IL-1β(pg/mL)：97.49±18.70 vs. 255.82±16.18，t=11.092，P=0.001；IL-6(pg/mL)：95.46±22.04 vs. 352.82±28.84，t=12.280，P=0.001]，提示过表达miR-132，可以增强ACh的抗炎作用(见图 1C-E)。

2. 2 抑制miR-132活性联合ACh对肺泡巨噬细胞炎症反应的影响

采用不同浓度(20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L)带有FAM荧光标记的inhibitor FAM NC转染NR8383细胞，进行最佳转染浓度筛选实验，结果发现100 nmol/L组的转染效率最高(见图 2A)，因此确定100 nmol/L为转染inhibitor的最佳浓度。

inhibitor FAM NC：inhibitor FAM荧光阴性对照；inhibitor NC：inhibitor阴性对照；LPS：脂多糖；ACh：乙酰胆碱；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6 ；NS：差异无统计学意义；a P＜0.05； n=3 图 2 抑制miR-132活性联合ACh对肺泡巨噬细胞炎症反应的影响 Fig 2 Effect of blockage of miR-132 combined with ACh on alveolar macrophage inflammatory
图选项

采用100 nmol/L的miR-132 inhibitor转染NR8383细胞抑制miR-132活性，LPS组中的结果显示miR-132 inhibitor上清液中TNF-α(t=-0.271，P=0.800)、IL-1β(t=-0.838，P=0.449)、IL-6(t=-0.902，P=0.418)的水平较inhibitor NC差异均无统计学意义(见图 2B-D)。

LPS+ACh组中的结果显示miR-132 inhibitor可逆转ACh介导的TNF-α、IL-1β、IL-6水平的下降[inhibitor NC与miR-132 inhibitor相比：TNF-α(pg/mL)：447.53±44.65 vs. 563.03±25.27，t=-3.899，P=0.018；IL-1β(pg/mL)：245.69±26.77 vs. 313.17±18.13，t=-3.615，P=0.022；IL-6(pg/mL)：340.23±27.84 vs. 428.44±38.16，t=-3.235，P=0.032](见图 2B-D)。

3 讨论

脓毒症是由于机体过度地炎症反应所致，多种免疫细胞参与脓毒症的炎症反应[11]，脓毒症时肺损伤常常最为明显，肺泡巨噬细胞是产生脓毒症肺损伤失控性炎症因子释放的主要始动免疫细胞，本研究采用大鼠肺泡巨噬细胞作为研究对象，探讨如何抑制肺泡巨噬细胞过度活化，将为脓毒症肺损伤的治疗提供实验依据。

MicroRNAs是机体内的一类小分子非编码RNA，许多microRNAs在脓毒症炎症反应中发挥重要的调控作用[12]，近年来的研究发现miR-132也参与了炎症反应的调控[13]。Lagos等[14]的研究发现miR-132可通过靶向p300转录辅助激活因子来调节抗病毒免疫反应。Kong等[15]的研究发现在髓样相关蛋白-8(MRP8)诱导的U251人星形胶质瘤细胞炎症反应中，miR-132通过靶向作用白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK4)，可负反馈性调节IL-1β、IL-6的含量，但不影响TNF-α的含量。本研究观察到在NR8383大鼠肺泡巨噬细胞中过表达miR-132或抑制miR-132活性，并不影响LPS诱导的细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，这可能与不同细胞类型及不同刺激模型有关；另外，体外培养环境与体内不同，我们推测缺少某些作用底物可能也是阻碍miR-132在体外对肺泡巨噬细胞炎症反应发挥调控作用的原因之一，这在后续实验通过加入外源性ACh后观察到miR-132可增强ACh的抗炎作用中得到初步证实，但尚需今后在体内实验中进一步验证。

胆碱能抗炎通路是在机体内主要由迷走神经及其神经递质ACh构成的一条抗炎通路，当传入迷走神经受到炎症因子刺激后，将炎症信号传入中枢神经系统，再由传出迷走神经释放递质ACh，激活巨噬细胞表面α7nAChR，抑制促炎因子释放[16, 17, 18, 19]。本研究观察到ACh的加入可减少LPS诱导的肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提示ACh对肺泡巨噬细胞炎症反应具有抑制作用。Shaked等[9]的研究发现miR-132可靶向作用AChE mRNA，由于AChE是一种特异性催化水解ACh的酶，可使ACh的降解减少，通过胆碱能通路发挥抗炎作用。Maharshak 等[20]研究发现在炎性肠病(IBD)患者的肠道炎症组织中miR-132水平明显高于正常肠组织；并且与健康试验者或轻度IBD患者相比，中-重度IBD患者血清中AChE的活性明显降低，提示miR-132通过调控AChE影响IBD患者的炎症反应。本研究观察到在大鼠肺泡巨噬细胞中过表达miR-132，可增强ACh的抗炎作用；抑制miR-132活性，可逆转ACh介导的TNF-α、IL-1β、IL-6水平的下降。综上笔者推测miR-132在肺泡巨噬细胞炎症反应中通过靶向AChE，减少ACh的水解，增强ACh的抗炎作用，从而调控肺泡巨噬细胞炎症反应，但仍有待进一步实验验证。

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