中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (10): 1126-1130
雌激素在百草枯中毒大鼠急性肺损伤中的作用
杨志洲, 刘红梅, 任艺, 孙兆瑞, 邵旦兵, 张炜, 孙宝迪, 唐文杰, 聂时南     
210002 南京,南京军区南京总医院急救医学科
摘要目的 研究雌激素在急性百草枯(Paraquat,PQ)中毒致大鼠急性肺损伤中的作用。 方法 将96只SD大鼠随机(随机数字法)分为空白对照组、雌激素对照组、百草枯染毒组、雌激素治疗组。测定不同时段大鼠肺组织匀浆中丙二醛含量(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活力,同时观察14 d时各组大鼠光镜下肺组织病理学改变。 结果 雌激素治疗能减轻PQ导致的MDA含量、SOD及GSH-PX活力的下降(P<0.05),减少PQ对肺组织的破坏和肺间质内的炎症细胞浸润。 结论 雌激素可通过减少PQ导致的氧化应激减轻PQ中毒大鼠的急性肺损伤。
关键词急性百草枯中毒     雌激素     急性肺损伤     氧化应激     大鼠     丙二醛     超氧化物歧化酶     谷胱甘肽过氧化物酶     中毒    
Effect of estrogen on acute lung injury patients with poisoning of Paraquat
Yang Zhizhou, Liu Hongmei, Ren Yi, Sun Zhaorui, Shao Danbing, Zhang Wei, Sun Baodi, Tang Wenjie, Nie Shinan     
Department of Emergency Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Nanjing, 210002, China.
Corresponding author: Nie Shinan, Email:shn_nie@sina.com
Abstract: Objective To study the effect of estrogen on acute lung injury patients with paraquat (PQ) poisoning. Methods Ninety-six SD rats were randomly(random number) divided into four groups, namely control group, estrogen control group, poisoning of Paraquat (PQ) and PQ treated with estrogen group. The levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase in rat lungs tissue were determined at different intervals. The histopathological changes of lung tissue of rats were observed under optic microscope in each group at 14 day. Results The estrogen decreased the concentration of MDA and activity of SOD and glutathione peroxidase in case of acute poisoning of Paraquat (P<0.05). At same time, treatment with estrogen could alleviate the lung injury and inflammatory cell infiltration in the interstitium of lung. Conclusions The estrogen can reduce the degree of oxidative stress in case of acute poisoning of Paraquat, alleviating the lung injury.
Key words: Acute poisoning of paraquat     Estrogen     Acute lung injury     Oxidative stress     Rat     Malondialdehyde     Superoxide dismutase     Glutathione peroxidase     Poisoning    

百草枯(paraquat PQ)在我国应用广泛,中毒事件时有发生,目前尚无有效的治疗方法,病死率居高不下,患者常死于急性肺损伤和严重肺纤维化导致的呼吸衰竭[1]。PQ的中毒机制尚不完全清楚,目前认为和PQ活化后产生大量的超氧化物分子损伤细胞有关[2],PQ导致的线粒体损伤在肺纤维化中作用越来越受到重视[3]。研究表明雌激素对急性肺损伤有保护作用,其保护机制涉及雌激素在线粒体中的抗氧化作用[4]。目前尚无雌激素在百草枯中毒中作用的研究,本实验通过建立PQ中毒大鼠急性肺损伤模型,用雌激素对PQ中毒大鼠进行干预,观察雌激素的疗效并研究作用机制,为探索新的治疗方法提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康清洁级SD雄性大鼠(Sprague-Dawley rats)96只,体质量(220±20)g,购于由南京军区南京总医院医学动物实验中心。

1.2 实验试剂

百草枯溶液(浓度20%,W/V),购于南通先正达作物保护有限公司,雌激素购自美国西格玛公司,MDA、SOD及GSH-PX试剂盒购自南京建成生物工程研究所,TUNEL细胞凋亡检测(TUNEL Apoptosis Assay)试剂盒购于罗氏公司。

1.3 实验分组

按照随机数字表法将96只大鼠(均为雄性)随机分为4组,每组24只,分别为空白对照组(NS组)、雌激素对照组(E组)、百草枯染毒组(PQ组)、雌激素治疗组(ET组)。①空白对照组:在实验的第1天9时给予与百草枯染毒组等量的生理盐水,在实验每天(即第1、2、3、4天)的相同时间点(上午11时)给予与雌激素治疗组相等的生理盐水;②雌激素对照组:在实验的第1天9时给予与百草枯染毒组等量的生理盐水,在实验每天的相同时间点(上午11时)给予5 mg/kg雌激素;③百草枯染毒组:在实验的第1天9时给予一次性腹腔注射20%百草枯20 mg/kg染毒,在实验每天相同时间点(上午11时)给予与雌激素治疗组相等的生理盐水;④雌激素治疗组:在实验的第1天9时一次性腹腔注射20%百草枯20mg/kg染毒,在实验的每天相同时间点(上午11时)给予5 mg/kg雌激素。

1.4 标本处理

在给药后6 h取样,即实验的第1、2、4天下午15时,每组随机选取8只大鼠取样。取样前用氯胺酮麻醉,迅速分离肺组织,切取右侧肺组织置于-80 ℃冰箱中保存,这部分肺组织用于MDA、SOD、GSH-PX的检测。同时取相同部位肺组织(左下肺)置于-4 ℃冰箱中,用于HE染色制片。

1.5 检测方法

检测肺组织匀浆中的MDA含量、SOD和GSH-PX的活性,硫代巴比妥酸比色法测定MDA,黄嘌呤氧化酶法和二硫代双硝基苯甲酸(dithio-bis-nitrobenzoic acid,DTNB)比色法测定SOD和GSH-PX活力。肺组织HE染色光镜观察。

1.6 统计学方法

用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数土标准差(x±s)表示,多组均数间比较用完全随机设计资料的单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 肺组织匀浆中各指标的变化 2.1.1 MDA含量的变化

染毒组肺组织匀浆中MDA含量在6 h后逐渐升高,72 h达高峰,在3个时间段,染毒组肺组织原浆中MDA含量均高于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);雌激素治疗组在第6、24小时与染毒组相比,肺组织原浆MDA含量差异无统计学意义,在第72小时低于染毒组,差异具有统计学意义(P<0.05),但高于对照组(P<0.05)。见表 1图 1

表 1 各时间段肺组织原浆中酶指标的变化 Table 1 Trends of MDA、SOD、GSH-PX of lung in each group at different time
(nmol/L,8,x±s)
组别MDASODGSH-PX
  6 h
  空白对照组0.712 ±0.038 12.384 ±0.590 210.392±17.954
  雌激素组0.717 ±0.051 12.213 ±0.600 208.694±19.350
  染毒组1.309 ±0.093a 10.739 ±0.402a 163.732±15.648a
  染毒治疗组1.257 ±0.113a 10.406 ±0.516a 169.012±16.328a
24 h
  空白对照组0.717 ±0.040 12.389 ±0.979 212.865±19.047
  雌激素组0.707 ±0.067 12.217 ±0.996 215.034±18.463
  染毒组1.368 ±0.159a 9.349 ±0.333a 143.648±13.634a
  染毒治疗组1.258±0.125a 9.816 ±0.511ab 155.230±14.037ab
72 h
  空白对照组0.715 ±0.044 12.804 ±1.045 213.401±18.928
  雌激素组0.727 ±0.056 12.640 ±1.063 209.857±17.084
  染毒组1.461 ±0.146a 8.358 ±0.305a 74.832±9.340a
  染毒治疗组1.269 ±0.077ab 9.330 ±0.473ab 108.201±10.192ab
注:与空白对照组比较,aP<0.05;与染毒组比较,bP<0.05
图 1 各时间段肺组织原浆中MDA、SOD、GSH-PX变化趋势 Fig 1 Trends of MDA、SOD、GSH-PX of lung in each group at different time
2.1.2 SOD活力的变化

染毒组肺组织匀浆中SOD活力在6 h后逐渐降低,72 h达最低,在3个时间段,染毒组肺组织原浆中SOD活力均低于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);雌激素治疗组在第6小时与染毒组相比,肺组织原浆SOD活力差异无统计学意义,在第24和72小时时点高于染毒组,差异具有统计学意义(P<0.05),但低于对照组(P<0.05)。见表 1图 1

2.1.3 GSH-PX活力的变化

染毒组肺组织匀浆中GSH-PX活力在6 h后逐渐降低,72 h达最低,在3个时间段,染毒组肺组织原浆中GSH-PX活力均低于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);雌激素治疗组在第6小时与染毒组相比,肺组织原浆GSH-PX活力差异无统计学意义,在第24和72小时时高于染毒组,差异具有统计学意义(P<0.05),但低于对照组(P<0.05)。见表 1图 1

2.2 各组肺组织病理学改变

空白对照组和雌激素对照组光镜下表现正常,肺泡结构清晰完整,肺泡腔及肺间质无渗出,无炎症细胞浸润。PQ染毒组可见肺泡正常结构消失,肺泡闭塞塌陷,肺间质内大量炎症细胞浸润。雌激素治疗组和PQ染毒组相比,肺泡结构破坏较少,炎症细胞浸润较轻,见图 2

A:空白对照组;B:雌激素对照组;C:PQ染毒组;D:雌激素治疗组。均为14 d肺组织光镜下表现 图 2 各组肺组织14 d光镜下表现(HE×100) Fig 2 Light microscopic observation of lung in each group on 14 day(HE×100)
3 讨论

百草枯是二吡啶类除草剂,1955年发现其具有除草活性,因其对环境无害,目前应用广泛[5]。我国的农业生产中,百草枯也很常用,百草枯中毒事件时有发生,大多数为故意口服[6],1966年Bulhvant[7]首次报道了百草枯中毒死亡病例。百草枯中毒涉及多个器官,包括肺、肾脏、肝脏、胃、肠道、心脏等,其中肺中的药物浓度最高,对肺的损伤也最严重[8, 9]

患者可出现急性肺损伤(acute lung injury ALI)和严重的肺纤维化,目前无有效的治疗方法,口服致死率大约为60%~87.8%,总病死率为20%~75%,患者大多死于急性肺损伤及肺纤维化[10],寻求有效的治疗方法是临床亟需解决的问题。PQ 中毒的机制尚不完全清楚,主要机制包括:①氧化损伤:目前认为氧化损伤是PQ中毒的主要机制,PQ 和多胺的结构相似,能被肺泡上皮细胞主动摄取,PQ在肺组织中产生大量超氧化物破坏细胞膜结构,导致细胞变性坏死,胶原沉积、纤维细胞增生,从而产生急性肺损伤和肺纤维化[11, 12]。②炎症反应:PQ中毒时,肺间质和肺泡内大量炎症细胞浸润和细胞因子释放,涉及的细胞因子包括:IL-1α、IL-1b、IL-6、IL-8、TNF-α等,这些炎症细胞和细胞因子的释放将加重急性肺组织损伤和促进肺纤维化的形成[13]。本课题组也正在进行细胞因子在PQ中毒中作用机制的研究。③线粒体损伤:PQ中毒时,线粒体发生脂质过氧化,线粒体内ATP生成减少,细胞内和线粒体内出现钙超载,严重影响细胞结构和功能[14]。④其他机制:PQ可在体外抑制大鼠肺微血管内皮细胞的增殖,并诱导其凋亡[15];细胞外基质调节紊乱[16],基质金属蛋白酶抑制物和胶原酶的代谢异常等参与了肺纤维化的形成。

近年来,PQ导致的线粒体损伤在急性肺损伤和肺纤维化的发生和发展中的作用越来越受到重视,PQ能促进线粒体内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species,RNS)的产生,从而产生脂质过氧化。同时消耗大量NADP,造成线粒体产生ATP减少,细胞能量代谢紊乱导致细胞内环境稳态的破坏,造成严重的细胞损伤。

雌激素在体内广泛存在,属于甾体类激素,雌激素通过调节细胞内蛋白质的合成发挥生物学效应。研究发现雌激素具有调节线粒体功能的作用:雌激素可抑制线粒体中ROS的合成[17~18],能减少H2O2介导的还原型谷胱甘肽(glutathione GSH)的消耗[19],同时雌激素还具有稳定细胞膜电位[19]和增加线粒体内ATP合成的作用[20]。现已明确雌激素可对线粒体产生保护作用,雌激素可能可减轻PQ中毒时发生的急性肺损伤和抑制肺纤维化的形成。

丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)能可靠地反映机体内脂质过氧化程度[21, 22]。MDA是氧自由基介导的脂质过氧化反应的产物,MDA的量反映机体内脂质过氧化的程度。SOD和GSH-PX是肺内抗脂质过氧化系统的主要酶,SOD能清除超氧阴离子,GSH-PX能催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应,SOD和GSH-PX用于反映机体清除自由基的能力。

本实验的设计依据是PQ中毒引起的线粒体损害可导致急性肺损伤,而雌激素具有线粒体保护作用。实验发现,染毒组大鼠肺组织匀浆中MDA含量较对照组明显升高,SOD和GSH-PX活力明显下降,这表明大鼠百草枯中毒后出现了明显的氧化应激表现。雌激素治疗组MDA含量较染毒组有所下降,SOD和GSH-PX活力有所上升,这说明雌激素能在一定程度上降低肺组织中的脂质过氧化,从而降低急性肺组织损伤。从病理上看,雌激素治疗能减轻PQ对肺组织的破坏,减少肺间质内的炎症细胞浸润。

本研究观察了雌激素与PQ中毒大鼠肺组织中氧化应激反应的关系,发现雌激素可降低PQ中毒大鼠肺组织早期的脂质过氧化,具有一定的保护作用,雌激素可能是通过调节肺组织中线粒体功能而发挥保护作用的,雌激素可能成为治疗PQ中毒的一种新药。雌激素早期的急性肺损伤的保护作用是否能减轻后期的肺纤维化的形成还有待进一步研究。雌激素的保护作用机制可能还涉及其他方面,如降低炎症细胞浸润和细胞因子的释放,还有待进一步证实,本课题组也正在进行相关研究。

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