2021, Vol. 30
有机磷农药(organophosphorus pesticides, OP)是一类脂溶性高、疏水性强、易与蛋白结合的有机磷酸酯或硫化磷酸酯化合物，长期接触可明显损伤血管内皮细胞功能，诱发多种血管性疾病，如动脉粥样硬化，糖尿病等[1-3]。氢溴酸山莨菪碱(anisodamine hydrobromide, AniHBr)作为一种胆碱能和α1肾上腺素能受体拮抗剂，具有稳定细胞质膜、抗脂质过氧化、拮抗胆碱能受体、抗凝血与促纤溶等药理作用[4]。最新研究发现AniHBr可作用于内皮细胞改善脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)导致的微循环障碍[5]。然而关于AniHBr是否对敌敌畏损伤的内皮细胞具有保护作用鲜有报道。基于此，本研究通过建立敌敌畏损伤的内皮细胞模型，观察AniHBr预处理对细胞活性的影响，探讨不同浓度AniHBr对敌敌畏损伤的内皮细胞的保护作用。
1 材料与方法 1.1 材料细胞株：人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)：购自内蒙古大学细胞库。
实验用主要试剂及仪器：CCK-8试剂盒（北京全式金中国），氢溴酸山莨菪碱（成一制药中国），77.5%敌敌畏（天津华宇中国），胎牛血清（SclenCell美国），ECM培养基（SclenCell美国），CO2细胞培养箱（Thermo美国），酶标检测仪（Molecular Devices SpectraMax i3美国）。
1.2 方法 1.2.1 实验分组实验设置6个分组，分别为空白组（含ECM、细胞和CCK-8溶液）、敌敌畏组（含ECM、细胞、CCK-8溶液和敌敌畏）、敌敌畏+AniHBr组（分别含ECM、细胞、CCK-8溶液、敌敌畏和5 mg/L、100 mg/L、1 600 mg/L、8 000 mg/L浓度的AniHBr），每个小组4个副孔。
1.2.2 实验方法按实验设计将细胞悬液转移至96孔板中（100 μL/孔）并标记组别，放入细胞培养箱中预培养12 h。敌敌畏+AniHBr组按分组每孔加入10 μL不同浓度的AniHBr，细胞培养箱中孵育4 h。敌敌畏组和敌敌畏+AniHBr组分别每孔加入10 μL敌敌畏，继续培养30 min后，各组每孔中加入10μL CCK-8溶液。孵育2~4 h后应用酶联免疫检测仪测450 nm双波长处吸光度(OD值)，计算细胞活力并观察颜色变化。
1.2.3 敌敌畏损伤内皮细胞模型的建立用PBS将敌敌畏稀释成分别为1:50、1:70、1:90、1:110(敌敌畏: PBS)浓度组，与细胞孵育30 min后测OD值，并计算细胞活力。
1.2.4 AniHBr对内皮细胞活力的影响用无血清ECM培养基将AniHBr稀释成5 mg/L、100 mg/L、1 600 mg/L、8 000 mg/L浓度组，测不同浓度AniHBr与细胞作用4 h后的OD值，并计算细胞活力。
1.2.5 AniHBr对敌敌畏损伤的内皮细胞活力的影响用无血清ECM培养基将AniHBr稀释成5 mg/L、100 mg/L、1 600 mg/L、8 000 mg/L浓度组，与细胞孵育4 h后测与最佳损伤浓度的敌敌畏作用细胞30 min后的OD值，并计算细胞活力。
细胞活力(%)=[(实验组－空白组)/(阴性对照组－空白组)]×100%
1.3 观察指标① 各组细胞OD值；②加入CCK-8试剂反应后的颜色变化；③细胞活力。
1.4 统计学方法计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，采用SPSS 26.0软件进行统计分析。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 敌敌畏损伤内皮细胞模型的建立与空白组相比，敌敌畏组细胞OD值及细胞活力随着敌敌畏浓度降低逐渐升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。根据计算得出，当1:90浓度敌敌畏作用30 min时细胞存活率 > 50%，故选用1:90浓度敌敌畏与细胞作用30 min为最佳造模条件，见表 1。
| 敌敌畏组(敌敌畏: PBS) | |||||
| 指标 | 空白组 | 1:50 | 1:70 | 1:90 | 1:110 |
| OD值[L/(g·cm)] | 0.326±0.024 | 0.115±0.019b | 0.171±0.018b | 0.245±0.010b | 0.281±0.012a |
| 细胞活力(%) | 1 | 0.227±0.081b | 0.439±0.067b | 0.672±0.066b | 0.803±0.130a |
| 与空白组比，aP < 0.05，bP < 0.01 | |||||
与空白组相比，AniHBr (5 mg/L、100 mg/L、1 600 mg/L、8 000 mg/L) 组细胞活力及OD值差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表 2。
| AniHBr组(mg/L) | |||||
| 指标 | 空白组 | 5 | 100 | 1600 | 8000 |
| OD值[L/(g•cm)] | 0.394±0.014 | 0.391±0.027 | 0.381±0.014 | 0.374±0.030 | 0.368±0.031 |
| 细胞活力(%) | 1 | 0.990±0.080 | 0.962±0.052 | 0.936±0.084 | 0.921±0.086 |
与空白组相比，敌敌畏组细胞活力及OD值明显降低，差异有统计学意义(P < 0.01)；与敌敌畏组相比，敌敌畏+AniHBr 8 000 mg/L浓度组OD值差异有统计学意义(P < 0.05)，敌敌畏+AniHBr 1 600 mg/L和8 000 mg/L浓度组细胞活力差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)，其余各浓度组细胞活力及OD值差异均无统计学意义(P > 0.05)，见表 3。
| 指标 | 空白组 | 敌敌畏组 | 敌敌畏+AniHBr组(mg/L) | |||
| 5 | 100 | 1600 | 8000 | |||
| OD值[L/(g•cm)] | 0.476±0.089 | 0.270±0.043a | 0.287±0.048 | 0.308±0.045 | 0.326±0.050 | 0.378±0.078b |
| 细胞活力(%) | 1 | 0.506±0.061a | 0.545±0.050 | 0.599±0.070 | 0.647±0.118b | 0.687±0.065c |
| 注：与空白组比，aP < 0.01；与敌敌畏组比，bP < 0.05，cP < 0.01 | ||||||
与空白组相比，敌敌畏组和敌敌畏+AniHBr组吸光度降低，细胞活性减弱，反应后颜色变浅；与敌敌畏组相比，敌敌畏+AniHBr组吸光度高，细胞活性高，反应后颜色深，且随着AniHBr浓度的增加，吸光度、细胞活性依次升高，颜色依次变深，见图 1。空白组细胞贴壁生长，呈铺路石样；敌敌畏组细胞漂起、缩小呈圆形，细胞变形严重；敌敌畏+AniHBr组细胞形态学改变明显减轻，见图 2。
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| 图注：敌敌畏+AniHBr组随着AniHBr浓度增大颜色依次变深 图 1 加入CCK-8溶液温孵2 h后各组颜色变化 |
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| 空白组细胞贴壁生长，呈铺路石样；敌敌畏组细胞漂起、缩小呈圆形，细胞变形严重；敌敌畏+AniHBr组随着AniHBr浓度升高，细胞形态学改变明显减轻 图 2 HUVECs的形态学观察图 |
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有机磷农药中毒是机体强烈的应激反应过程，患者发生多器官功能障碍综合征[6]的同时会出现免疫功能低下[7]、炎性因子过度激活[8]，导致血管内皮功能损伤，出现微循环障碍和全身炎症反应综合征[9-10]，其中炎症反应为当前研究热点，值得注意的是，近年来已有不少研究发现炎症反应通常伴有氧化应激[11-12]。有机磷农药作为一种强氧化剂，可激活机体产生过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS生成上调可以导致钙调节失衡、线粒体功能障碍，激活核因子-κB（nuclear-factor kappaB，NF-κB）信号通路并促进炎性因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的分泌，进而导致凋亡级联激活，促使细胞发生功能障碍[13]。这进一步提示有机磷农药中毒与炎症反应和氧化应激有密切联系。
AniHBr可通过抑制炎症因子释放、保护冠脉内皮糖萼、减少细胞凋亡，发挥保护冠脉内皮功能和改善微循环等作用[14-15]。此外，AniHBr还可减弱LPS诱导的炎症因子升高、线粒体功能障碍和氧化应激，抑制肾小管上皮细胞凋亡[16]。韦义萍等[17]研究也进一步证实，AniHBr对5-氟尿嘧啶损伤的血管内皮细胞具有保护作用。使用AniHBr与细胞共同孵育4 h后OD值和细胞活力无明显变化，说明在一定时间内，不同浓度AniHBr对HUVECs活性无明显抑制作用，可排除实验中AniHBr对细胞活力的影响。同时，笔者在AniHBr对敌敌畏损伤的内皮细胞活力影响的研究中发现，使用AniHBr处理细胞后，细胞活力和OD值随AniHBr浓度增加呈上升趋势，当AniHBr增加到一定浓度时，结果有统计学意义。提示AniHBr与敌敌畏损伤的内皮细胞活力之间存在剂量-反应关系，内皮细胞活力随着AniHBr浓度的增加而升高，表明AniHBr对内皮细胞具有保护作用且呈浓度依赖性。
以往的研究表明，敌百虫及对氧磷可刺激血管内皮细胞发生氧化应激和炎症反应，使细胞膜通透性增加，导致细胞损伤[18-19]，而AniHBr作为一种M受体拮抗剂，可使ACh介导的α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)激活增加，从而激活胆碱能抗炎通路，抑制NF-κB信号通路激活，调节炎症因子的表达水平[20-21]。另有研究也证实山莨菪碱可完全阻断LPS作用下的HUVECs核提取液中NF-κB DNA的结合活性[22]。葛磊等[23]提出AniHBr通过影响NF-κB/IκB等信号通路减少炎性因子及ROS的产生，利于维护细胞氧化-抗氧化及促炎-抗炎细胞因子平衡，减轻细胞损伤。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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