中华急诊医学杂志  2018, Vol. 27 Issue (12): 1360-1364
脓毒症大鼠肠黏膜IL-6/STAT3信号通路对高迁移率族蛋白表达的调控作用
胥朵, 李建英, 王小众, 黄月红, 陈林均, 陈治新     
350001 福州,福建医科大学附属协和临床医学院(胥朵现在陕西省渭南职业技术学院附属医院呼吸内科工作),福建医科大学附属协和医院消化内科(李建英、王小众),消化内科研究所(黄月红、陈治新),福建医科大学附属协和医院感染科(陈林均)
摘要: 目的 通过脓毒症大鼠模型探讨IL-6/STAT3通路是否对高迁移率族蛋白(HMGB1)的表达起调控作用。方法 清洁级雄性SD大鼠120只,随机数字表法分为3组:假手术S组(n=40)、模型C组(n=40)和治疗T组(n=40)。S组行单纯剖腹术,C组和T组分别用盲肠结扎穿孔术构建脓毒症大鼠模型。T组术后1 h腹腔注射抗IL-6单克隆抗体,S组和C组同时腹腔注射等量乳酸钠林格液。分别于术后3 h、12 h、24 h、48 h从三组各取10只大鼠,留取血浆和肠黏膜组织标本,采用HE染色光镜下观察肠黏膜损伤情况并进行病理评分;分光光度法测定血浆中二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸含量;免疫组化法检测肠黏膜IL-6和HMGB1蛋白表达;Western-Blot检测p-STAT3表达情况。结果 C组和T组均可见不同程度的肠黏膜损伤,肠黏膜病理评分及DAO、D-乳酸在不同时间点均高于S组(P < 0.05);且与S组相比,C组和T组小肠黏膜的IL-6、HMGBl及p-STAT3蛋白表达明显增加(P < 0.05)。T组与C组相比,肠黏膜损伤有明显改善,病理评分及血浆DAO、D-乳酸含量下降(P < 0.05);IL-6、HMGBl及STAT3蛋白表达减低(P < 0.05)。小肠黏膜病理评分与IL-6和HMGB1蛋白表达在12 h、24 h、48 h存在显著正相关。结论 IL-6、HMGBl参与了脓毒症大鼠肠黏膜损伤,IL-6/STAT3信号通路可上调脓毒症大鼠肠黏膜组织HMGBl表达。
关键词: 脓毒症     肠黏膜组织     抗IL-6单克隆抗体     HMGB1     p-STAT3    
IL-6 /STAT-3 signaling pathway regulates the expression of high mobility group proteins 1 in intestinal mucosa of rats with sepsis
Xu Duo , Li Jianying , Wang Xiaozhong , Huang Yuehong , Chen Linjun , Chen Zhixin     
Union Clinical Medical College Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China (Xu D, works at Department of Respiration, Weinan Vocational Technical College); Department of Gastroenterology (Li JY, Wang XZ), Institute of Digestion (Huang YH, Chen ZX), Infectious Department (Chen LJ), Affliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China
Abstract: Objective To explore whether the IL-6/STAT3 signaling pathway regulate the expression of high mobility group proteins1 (HMGB1) in intestinal mucosa of rats with sepsis through the cecum ligation puncture (CLP). Methods One hundred and twenty male SD rats were randomly(random number) divided into three groups: sham operation group (group S, n=40), CLP group(group C, n=40) and anti-IL-6 monoclonal antibody group (group T, n=40). Rats in group S only received the simple laparotomy; Rats in group C and group T were established as a rat model of sepsis using CLP; rats in group T received the intraperitoneal injection of anti-IL-6 monoclonal antibody at 1 h after CLP, while the same volume of sodium lactate ringer' s solution was injected to rats in group S and group C. Ten rats in each group were sacrificed at 3, 12, 24 and 48 h, respectively, and intestinal mucosa specimens were collected for pathological examinations by HE staining. The protein expression of HMGB1 and IL-6 were detected by immunohistochemistry, STAT3-protein by Western blot.and the levels of diamine oxidase (DAO) and D lactic acid in plasma by spectrophotometric. Results Rats in group C and group T showed obvious intestinal damage to different degrees, significantly higher intestinal mucosa pathological scores and plasma levels of DAO and D-lactic acid compared with rats in group S (P < 0.05). The protein expression of IL-6, HMGBl and p-STAT3 of intestinal mucosa in group C and group T also significantly increased compared with that in group S (P < 0.05). The intestinal mucosa pathological score, plasma levels of DAO and D-lactic acid and protein expression of IL-6, HMGBl and STAT3 were decreased in group T compared with those in group C (P < 0.05). The intestinal mucosa pathological scores were positively correlated with the protein expression of IL-6 and HMGB1 at 12, 24, and 48 h, respectively. Conclusions IL-6 and HMGBl were involved in the intestinal injury of septic rats. IL-6/STAT3 signaling pathway could up-regulate the expression of HMGB1 in intestinal mucosa of septic rats.
Key words: Sepsis     Intestinal mucosa     Anti-IL-6 monoclonal antibody     HMGB1     p-STAT3    

脓毒症的发病是复杂的环境因素和遗传因素共同作用导致的获得性疾病[1-2]。大量研究证实肠道屏障损害是脓毒症发生发展过程的“扳机点”,因此研究脓毒症肠道损伤机制可为治疗脓毒症开启新思路。IL-6、高迁移率族蛋白(HMGB1)均为重要的炎性介质,并在不同的时相均为致炎的关键点,而JAK/STAT途径与两者的产生密切相关[3-4]。本实验旨在建立脓毒症大鼠模型,通过使用抗IL-6单克隆抗体抑制脓毒症大鼠肠道炎症因子IL-6表达,观察IL-6/STAT3信号通路介导的炎症反应,探讨该通路是否对HMGB1有调控作用,以期为脓毒症治疗找到新的突破点。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

抗IL-6及抗HMGB1单克隆抗体购自英国Abcam公司;磷酸化(p)STAT3单克隆抗体购自美国GeneTex公司;免疫组化检测试剂盒购自北京中山生物技术公司;Western印迹检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸试剂盒购自美国RD公司。

1.2 实验动物分组及构建模型

实验动物分组:清洁级雄性SD大鼠120只,体质量200~250 g,购于福州吴氏实验动物中心,许可证:SCXK(闽)2014-0005。按随机数字表法随机分为三组:假手术组(S组),模型组(C组),治疗组(T组)。实验动物购买后饲养一周,水合氯醛麻醉后沿腹正中线切口,C组及T组采用盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症模型,S组暴露盲肠,不行CLP,余操作同上。术后1 h T组腹腔注射抗IL-6单克隆抗体40 mg/kg,S组和C组腹腔注射等量乳酸钠林格液。分别在术后3 h、12 h、24 h、48 h从三组各取10只大鼠抽取心脏血5 mL,肝素抗凝,离心后置于-70 ℃冰箱备用。钝性分离小肠黏膜组织(距回盲部10 cm回肠),分块切割后用10%甲醛溶液固定,脱水包埋处理后制作石蜡切片,其余肠黏膜液氮冷冻,-70 ℃保存。

1.3 指标测定 1.3.1 小肠黏膜病理变化

肠黏膜组织石蜡切片HE染色后参照Chiu法[5], 将小肠黏膜损伤分为六级:0级正常黏膜绒毛结构;1级肠黏膜绒毛顶端上皮下间隙增宽;2级绒毛上皮下间隙进一步扩大,绒毛顶端上皮抬高与固有层剥离;3级绒毛两边上皮成块脱落;4级上皮完全脱落仅有固有膜结构;5级黏膜固有膜崩解,出现出血和溃疡。

1.3.2 血浆二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸测定

参照试剂盒说明书采用分光光度法分别测定血浆DAO及D-乳酸浓度。

1.3.3 免疫组化法检测小肠黏膜HMGB1和IL-6蛋白表达

具体操作按SP试剂盒说明。免疫组化结果判断:光镜下HMGB1阳性结果为细胞胞浆或胞核棕黄着色, IL-6阳性结果为细胞胞浆棕黄着色。每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)进行观察并摄片,用图像分析软件(Image Pro Plus 4.0)系统进行分析,计算阳性区域面积(area)、积分吸光度(IA),平均吸光度=IA/area,最后取平均光密度均值进行比较。

1.3.4 Western-blot检测小肠黏膜pSTAT3的表达

称取100 mg小肠黏膜组织提取总蛋白,50 μg样本蛋白经SDS-PAGE电泳分离,半干电转后将蛋白质转移到NC膜上,封闭液封闭2 h,加入兔抗p‐STAT3单克隆抗体(用抗体稀释液稀释至1:500)、鼠抗β‐actin单克隆抗体(1:1 000)后与相应的二抗杂交,室温中孵育膜1 h,ECL发光法凝胶成像显示电泳条带,用Image凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。分别取p-STAT3与β-Actin灰度值之比作为蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法

计量资料以均数±标准差(x±s)表示,各时间点三组的病理评分、血浆DAO及D-乳酸浓度测定、IL-6与HMGB1蛋白表达组间均数比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用SNK检验。各时间点小肠黏膜病理评分与其HMGB1、IL-6蛋白表达相关性采用Spearman秩相关分析。使用SPSS 17.0软件对数据进行处理,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 小肠黏膜形态变化及病理评分

S组各时间点肠黏膜未见明显异常,病理评分无差异。C组与T组随时间推移,炎症反应加剧,小肠黏膜病理评分增高,在12 h、24 h、48 h小肠黏膜病理评分均高于S组。C组在12 h可见炎性细胞的浸润,小肠绒毛上皮下间隙明显增宽,绒毛顶端上皮与固有层剥离,48 h小肠黏膜大部分坏死脱落,肠黏膜形态改变,并伴大量中性粒细胞浸润,巨噬细胞增多,炎症反应显著。T组各时间点较C组损伤程度明显减轻,评分明显低于C组,见表 1

表 1 各组大鼠各时间点小肠黏膜病理评分(x±s) Table 1 Intestinal mucosa pathological score of rats in different groups (x±s)
组别 3 h 12 h 24 h 48 h
S组 0.2±0.3 0.4±0.4 0.4±0.5 0.4±0.4
C组 0.5±0.6 2.6±0.7a 3.5±0.9a 4.6±0.8a
T组 0.4±0.6 1.8±0.7ab 2.8±0.6ab 3.4±0.8ab
注:与S组比较,aP < 0.05;与C组比较,bP < 0.05
2.2 血浆DAO及D-乳酸浓度测定

S组各时间点血浆DAO、D-乳酸浓度无明显差别,而C组及T组血浆DAO及D-乳酸浓度随时间延长逐渐增高,且在各时间点均高于S组,T组与C组相比,在12 h、24 h、48 h血浆DAO、D-乳酸浓度显著降低,见表 2

表 2 各组大鼠血浆DAO、D-乳酸含量(x±s) Table 2 The plasma levels of DAO and D-lactic acid in rats(x±s)
指标 组别 3 h 12 h 24 h 48 h
血浆DAO(U/mL) S组 2.97±0.22 3.03±0.12 3.12±0.13 3.30±0.14
C组 4.55±0.08a 6.55±0.37a 9.88±0.19a 14.30±0.45a
T组 4.11±0.51a 5.23±0.51ab 7.66±0.34ab 11.40±0.65ab
血浆D-乳酸(μg/mL) S组 8.96±0.47 9.19±0.30 8.87±0.34 8.92±0.57
C组 10.78±0.71a 15.83±0.18a 21.76±0.37a 29.85±0.22a
T组 10.07±0.30a 13.49±0.36ab 18.55±0.57ab 26.27±0.72ab
注:与S组比较,aP < 0.05;与C组比较,bP < 0.05
2.3 免疫组化法检测小肠黏膜IL-6与HMGB1蛋白表达

S组IL-6及HMGB1蛋白在各时间点表达无明显差异,与S组相比,C组和T组小肠黏膜IL-6、HMGBl表达明显增加,而与C组比较,T组小肠黏膜两者表达均减低,见表 3图 12

表 3 各组大鼠小肠黏膜IL-6、HMGB1免疫组化平均吸光度值(x±s Table 3 Average integral optical density value of the IL-6 and HMGB1 expressions of intestinal mucosa of rats(x±s)
指标 组别 3 h 12 h 24 h 48 h
IL-6 S组 0.120 1±0.002 6 0.091 3±0.035 1 0.134 2±0.021 3 0.118 0±0.012 2
C组 0.295 1±0.021 3a 0.471 5±0.002 3a 0.564 3±0.015 8a 0.502 1±0.023 5a
T组 0.260 1±0.032 1ab 0.414 0±0.014 3ab 0.520 1±0.021 2ab 0.483 7±0.011 4ab
HMGB1 S组 0.291 0±0.002 1 0.282 3±0.011 7 0.303 2±0.013 2 0.311 2±0.012 4
C组 0.301 1±0.003 6 0.367 5±0.023 0a 0.512 4±0.010 8a 0.628 0±0.014 2a
T组 0.291 3±0.014 3 0.342 2±0.006 7a 0.461 0±0.013 8ab 0.575 3±0.020 1ab
注:与S组比较,aP < 0.05;与C组比较,bP < 0.05

图 1 各组大鼠小肠组织IL-6表达(SP×400) Figure 1 The expression of IL-6 protein in intestinal mucosa of rats in different groups

图 2 各组大鼠小肠粘膜HMGB1蛋白表达(SP×400) Figure 2 The expression of HMGB1 protein in intestinal mucosa of rats
2.4 Western-blot检测小肠黏膜p-STAT3蛋白表达

S组小肠黏膜p-STAT3在各时间点的蛋白表达均无明显差别,C组和T组在12 h、24 h、48 h的p-STAT3蛋白表达均高于S组,随时间延长C组p-STAT3的表达逐渐升高,T组各时间点表达趋势同C组,但表达水平相对较低,见表 4图 3

表 4 各组大鼠不同时间点小肠黏膜p-STAT3蛋白表达(x±s) Table 4 The expression of p-STAT3 protein in intestinal mucosa of rats(x±s)
组别 3 h 12 h 24 h 48 h
S组 0.13±0.02 0.13±0.01 0.14±0.03 0.13±0.03
C组 0.22±0.05 0.57±0.05a 0.73±0.07a 0.86±0.06a
T组 0.25±0.03 0.43±0.04ab 0.52±0.04ab 0.41±0.03ab
注:与S组比较,aP < 0.05;与C组比较,bP < 0.05

图 3 各组大鼠小肠组织p-STAT3蛋白表达 Figure 3 The expression of p-STAT3protein in intestinal tissues of rats
2.5 小肠黏膜病理评分和HMGB1、IL-6蛋白表达相关性分析

Spearman秩相关分析结果表明:小肠黏膜病理评分与其HMGB1、IL-6蛋白表达成正相关,见表 5

表 5 小肠黏膜病理评分和HMGB1、IL-6蛋白表达相关性分析 Table 5 Correlation analysis of histopathologic grading respectively compared with the expressions of HMGB1 and IL-6
指标 病理评分
3 h 12 h 24 h 48 h
HMGB1 r 0.237 0.572 0.665 0.702
P 0.078 0.026 0.010 0.008
IL-6 r 0.505 0.610 0.823 0.598
P 0.029 0.019 0.005 0.021
3 讨论

在脓毒症发生早期,促炎因子与抑炎因子经常处于平衡/失衡相互对立统一的变化中,在众多促炎因子中,前炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6起重要作用[6]。在SIRS和脓毒血症患者中,IL-6水平同其APACHEⅡ评分之间有显著的正相关性[7],因此,IL-6可作为反映机体炎症和疾病严重程度的重要指标。HMGB1是重症炎性疾病发病机制中的关键调控因子[8], 可引起脓毒症时肺、脑等脏器的损害,其表达水平与脓毒症患者预后高度相关[9-11]。为观察这两种炎症介质在脓毒症大鼠肠道损伤中的作用,本实验采用CLP法构建脓毒症大鼠模型,通过光镜下观察小肠黏膜形态学改变及检测血中DAO与D-乳酸来评估肠道损伤程度。DAO存在于小肠黏膜上层绒毛细胞的胞质中D-乳酸主要来源于肠道固有细菌的代谢和裂解产物, 当肠黏膜屏障受损时两者可进入血液循环, 因此检测血液中DAO、D-乳酸可以反映肠黏膜上皮细胞损伤程度和通透性改变[12-13]。本研究显示脓毒症组随时间推移,小肠黏膜炎症反应加剧,小肠组织病理评分及DAO、D-乳酸含量逐渐升高,并且HMGBl、IL-6蛋白表达明显增加,Spearman秩相关分析结果表明小肠黏膜病理评分与其IL-6、HMGB1蛋白表达成正相关,提示IL-6、HMGBl参与了脓毒症大鼠肠道损伤。

IL-6与受体结合后,与信号转导蛋白gpl30形成复合物而激活JAK2,JAK2可激活STAT3[14]。活化的STAT3易位到细胞核内后与相应基因启动子的STAT3结合位点结合,诱导HMGBl转录活性升高[15]。转录因子STAT3是一种膜上激活的核转录调节蛋白,通过JAK/STAT途径参与多种生长因子与细胞因子等细胞内信号转导[16]。有体外研究证实JAK2/STAT3信号通路参与了LPS诱发大鼠腹腔巨噬细胞HMGBl合成[17]。本实验通过注射抗IL-6单克隆抗体,特异性地与IL-6结合, 阻止IL-6与IL-6R结合形成IL-6/IL-6R/gpl30复合体, 从而阻止下游信号通路激活,抑制IL-6介导的促炎作用。实验显示抗IL-6单克隆抗体处理组病理评分及DAO、D-乳酸较单纯脓毒症组明显减低,IL-6、HMGBl、p-STAT3蛋白表达也明显下降。因此笔者推测抗IL-6单克隆抗体可能通过抑制IL-6而抑制了脓毒症大鼠肠黏膜组织p-STAT3的激活,进而抑制HMGB1蛋白的释放而减轻肠道黏膜损伤。反之也表明IL-6/STAT3信号通路具有上调脓毒症大鼠肠黏膜组织HMGBl的作用。因此,临床上以IL-6/STAT3-HMGB1发病机制作为干预的靶点对脓毒症肠道损伤治疗或许成为可能。

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