青褶伞[chlorophyllum molybdites (G. Mey.) massee]又称大青褶伞、大青褶皱伞，在南方一些地区被叫作青褶环伞、铅绿褶菇、绿孢环柄菇、毒绿褶菇，是一种大型真菌，隶属于真菌界(fungi)，担子菌门(basidiomycota)，伞菌纲(agaricomycetes)，伞菌目(agaricales)，伞菌科(agaricaceae)，褶伞属(chlorophyllum)。该菌广泛分布于世界各地的温带和亚热带地区，在中国主要分布于广东、海南、湖南、江苏、四川、西藏、香港和云南等省份，于夏秋季生长在草坪、阔叶林或云南松等地上^{[1, 2, 3]}。

青褶伞可引起胃肠炎型中毒，在北美被认为是最常见的被人误食的毒蘑菇种类之一^{[4, 5]}。中毒潜伏期为1～6 h，大部分中毒患者在进食1～3 h后会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻，大便呈稀水样便，部分出现血性稀水便，虽然部分患者症状十分严重，但到目前为止尚无死亡病例报道。

青褶伞与一些可食用的蘑菇形态相似，也易与部分剧毒种的鹅膏菌混淆，导致过度治疗。本文通过对发生在南京的一起涉及2人的中毒事件处理，总结了青褶伞在国内分布、建立鉴定方法，同时对2例患者资料进行了汇总和分析。

江苏省南京市中毒2人，均为女性，年龄分别为51岁和36岁，职业为工人，以及从市区居民小区内采集的患者食用的蘑菇。

1.2 流行病学调查

江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院)急诊科经治医师分别对患者及其家属进行了访谈，详细调查了其可疑暴露情况和接触经过，逐步锁定可疑餐次及可疑食品，结合临床特征分析，高度怀疑食用野生不明蘑菇引发该起突发中毒事件；医院同时提供了中毒患者的主要临床表现、诊断、治疗以及病情变化等情况，并做相应摘录和分析。

中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所将接收到的疑似毒蘑菇进行拍照、记录，并编号为140703-01。利用便携式鼓风干燥机将标本在45°C条件下彻底干燥，进行形态学和分子生物学鉴定。

主要包含宏观形态和显微结构观察。宏观形态主要观察子实体颜色、大小、形状、质地、菌盖表面特征、菌褶特征(颜色、生长状态)、菌柄特征(颜色、长短、粗细、是否被绒毛、是否有菌幕)、菌环特征、是否有特殊气味和味道、寄主及采集日期和地点等。显微结构主要观察各部位菌丝的有无锁状联合、分枝状况、排列状况等；观察子实层的主要特征包括担子的形状、大小、担子梗的数目及长短、囊状体的有无、形状及大小；观察担孢子的主要特征包括形状、大小、在各种浮载剂中的反应。

使用The Phire Plant Direct PCR试剂盒(Finnzymes Oy,Finland)对蘑菇干标本进行DNA提取和PCR产物扩增。取少量干燥的蘑菇标本置于1.5 mL离心管中，加入50 μL稀释缓冲液裂解，室温孵育5 min，所得上清液用于PCR反应体系的扩增模板。

采用引物ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G)和ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)^[6]对该标本的转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行扩增。30 μL反应体系中含1 μL上清液。扩增反应程序为：98°C预变性5 min；98 ℃变性5 s，58°C复性5 s，72 ℃延伸5 s，40个循环后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。反应结束后，取3 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将电泳条带单一明亮、片段大小约650 bp的样品送交上海生工生物工程股份有限公司测序。

将测得的ITS序列与网上下载的序列(表 1)用Clustalx1.83进行比对，用BioEdit 7.0.5.3进行手工校对^{[7, 8]}。系统发育树的构建采用最大简约法，使用PAUP* 4.0b10软件^[9]。在最大简约性分析法中，所有参与分析序列上的位点均作为等权处理，位点上的空格视为缺失。Max-trees设为5 000，其他参数选择默认值，采用启发式搜索进行1 000次自举分析^[10]。

2014年7月1日19:30左右，南京市某小区居民2人，共同进食了在自己居住小区草坪上采摘的野生蘑菇(白色，鸡蛋大小)，2名患者均为女性，分别为51岁和36岁；其中51岁患者约食用了10个蘑菇，36岁患者食用了16个蘑菇，约23:30左右，两人接连出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，51岁患者伴有黑朦、胸闷、出冷汗等，潜伏期约4 h。两名患者均为工人。两人于当日23:50到江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院)急诊科就诊，于7月4日康复出院。

两位患者就诊后，进行了血、尿、便常规，电解质、肝功能、肾功能、血脂分析、肌酸激酶等血生化检测，并进行了凝血功能、hs-Tn高敏肌钙蛋白T和Myogl肌红蛋白检测。患者主要临床表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻(呈稀水样便)，51岁患者食用毒蘑菇5 h后谷丙转氨酶和谷草转氨酶(干化学法，89.50 U/L、107.30 U/L(女性正常参考值分别为：7~40 U/L、13~35 U/L)呈一过性升高，并于18 h后恢复正常，其中，谷草转氨酶于59 h复查略高(55.8 U/L)；而食用量较大的36岁患者呕吐少量淡红色液体，7月2日曾有淡血性稀水便，后再次转为黄色稀水便；两位患者均无头晕、头痛、晕厥、心慌等症状。经给予足量补液、糖皮质激素、保肝、青霉素抗感染等对症支持治疗，两位患者7月2日以后未再有呕吐、腹泻，继续留观1 d后，于7月4日康复出院。

观察标本宏观和微观结构，鉴定为青褶伞(chlorophyllum molybdites)，如图 1A。

图 1 青褶伞的子实体照片(照片由患者提供) A-B: 幼时子实体照片 C-D: 菌盖展开后子实体照片 Fig. 1 Basidioma of chlorophyllum molybdites (offerred by one patient). A-B: young basidioma of C. molybdites,C-D: mature basidioma of C. molybdites

图选项

宏观结构：子实体中等至大型。菌盖直径8～17 cm，初半球形，成熟后近平展，有时中央具钝脐突，表面白色，具褐色至黑褐色鳞片；菌褶离生，较密，不等长，幼时白色，成熟后浅绿色至绿褐色，干燥后蓝绿色至灰绿色；菌柄长10～18 cm，直径0.8～1.5 cm，圆柱形，近白色，近基部稍膨大；菌环上位，多宿存，双层，上表面呈白色，下表面呈褐色。

显微结构：担子棍棒状，多具4个小梗，基部无锁状联合，(27～36) μm× (11～14) μm；担孢子宽椭圆形至宽杏仁形，厚壁，光滑，浅橄榄绿色，拟糊精反应，平截，具芽孔，(9～10)μm × (6.5～8) μm。担子果各部位皆无锁状联合。

图 2为应用ITS序列构建的青褶伞系统发育树拓扑结构图。可以看到，共43个单元，763个特征位点，其中包括443个恒定特征，69个无简约信息可变特征，以及251个简约信息特征。简约法共得到1个MP树，系统发育树的TL为646，CI为0.715，RI为0.888，RC为0.635，HI为0.285。此外，系统发育结果表明，检测样本140703-01与青褶伞聚类到同一分枝，获得极高支持率(图 2,MP=96%)。因此鉴定该标本为青褶伞。

图 2 基于ITS序列构建的青褶伞系统发育树，仅高于50%的支持率被标注于分枝上(黑体突出显示的为事件标本序列 Fig. 2 Phylogenetic tree of chlorophyllum molybdites inferred from maximum parsimony (MP) analysis based on ITS dataset Only maximum parsimony bootstraps (PB) over 50% are reported on the branches(Sequence from poisoning case specimen was in bold)

图选项

经过系统流行病学调查、临床特征分析和实验室鉴定检测分析，基本明确本次毒蘑菇中毒事件为以消化系统症状伴一过性肝功能损害为主要表现的一起青褶伞中毒事件。

目前，国内共报道过5种褶伞属真菌，其中，青褶伞是最常见的毒蘑菇种类^{[1, 2]}，能够引起强烈的胃肠道反应，但至今未报道过因误食该种而引起的死亡事件。青褶伞的主要鉴别特征为菌褶成熟后呈蓝绿色，孢子浅橄榄色，褶缘囊状体宽棒状，极易与可食的粗鳞青褶伞(chlorophyllum rhacodes)相混淆，但后者菌褶成熟后呈白色，且孢子无色^[1]。

由于青褶伞具有菌环，有时会将其与剧毒的鹅膏(amanita)种类相混淆，尤其是白色的剧毒鹅膏种类，如致命鹅膏(amanita exitialis)、黄盖鹅膏白色变种(A. subjunquillea var. alba)、淡红鹅膏(A. pallidorosea)和裂皮鹅膏(A. rimosa)等，但值得注意的是，几种剧毒鹅膏在菌柄基部具有菌托，且菌环一般为膜质，单层，菌褶也为白色至奶油色^{[11, 12]}。