失血性休克(hemorrhagic shock,HS)是创伤和外科手术的常见合并症,是临床常见的急危重症之一,能够引起全身炎症反应综合征(SIRS),进一步发生多器官功能障碍(MODS) [1]。HS诱导固有免疫系统的激活是引起全身炎症反应综合征的主要原因,从而促发机体多器官功能障碍。由HS引起的MODS最早表现为急性肺损伤(ALI),而阻断或减弱固有免疫的炎症激活,减少炎症因子的释放,对于减轻HS诱导的MODS有着重要作用[2]。
炎症小体(inflammasome)是机体固有免疫的重要组成部分,在HS的病理生理损伤过程中起着重要作用。HS引起的组织低灌注和液体复苏引起的再灌注均可使组织释放大量的活性氧自由基(ROS),后者能诱导炎症小体活化释放IL-1β[3]。而IL-1β 作为强有力的炎症起始因子,诱导产生更多的细胞损伤因子[4]。
研究证明治疗性低体温(therapeutic hypothermia,TH)可减弱缺血缺氧引起的脑组织损伤[5, 6]。这是由于低温能够减少HS期组织的能量消耗,从根本上减轻细胞损伤[7] 。本研究拟检测治疗性低温液体复苏是否通过抑制炎症小体通路的活化来减弱肺组织的损伤。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂本实验在第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室完成,选择24只健康雄性SD大鼠(由第四军医大学动物实验中心提供 )作为实验对象,体质量250 g左右。实验试剂:戊巴比妥钠(Merck,德国),乳酸林格钠注射液(山东齐都),NLRP3、IL-1β和GAPDH的引物(Takara,日本),兔源抗大鼠NLRP-3抗体 (Santa 美国),Caspsae-1 (Abcam,英国),β-actin(博士德,武汉),山羊抗兔IgG抗体(Thermo 美国)。实验仪器:多道生理监测仪(成都仪器厂)。
1.2 实验方法 1.2.1 动物分组及模型制备将24只雄性SD大鼠随机(随机数字法)分为假手术组(n=8)、常温复苏组(normothermia resuscitation,NR)(n=8)、低温复苏(hypothermia resuscitation,HR)(n=8)。大鼠手术前12 h禁食,通过腹腔注射40 g/L戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,固定。颈前部和双侧腹股沟处备皮后,逐层钝性分离,依次分离右侧颈总动脉、右侧股动脉和左侧股静脉,使用PE50管插管(其中右侧颈总动脉插管插至左心室,左股静脉和右股动脉插管均插入约0.5 cm即可),固定后经张力换能器连接至生物信号采集系统,分别为记录左心室内压(LVP)建立给药途径和记录动脉血压(股动脉插管也用于构建模型放血)所用。连接针状电极,备用心电图检测。将大鼠开始少量、缓慢从动脉插管放血,直至休克标准(平均动脉压30~40 mmHg,1 mmHg=0.133 kPa),放血时间控制在15 min左右,维持1 h制成HS模型[8] 。
1.2.2 标本留取Sham组大鼠麻醉固定后仅插管但不放血。NR组休克模型1 h后,保持体温37 ℃,进行乳酸林格溶液复苏至MAP达90 mmHg,维持1 h;HR组休克模型1 h后,腹部喷洒酒精降温和加热毯加热保持大鼠体温33 ℃,乳酸林格溶液复苏至MAP达90 mmHg,维持1 h。拔出血管置管,缝合切口。大鼠放置在动物房4 h后,腹腔注射过量戊巴比妥钠处死。开胸留取大鼠整个肺脏,左侧肺叶用于测定干湿质量比,右侧肺下叶一部分用于制成组织切片,中叶和上叶分别经液氮速冻置于-80 ℃冰箱保存用于RT-PCR和Western blotting。
1.2.3 肺组织HE染色观察取右下叶肺组织,4%多聚甲醛固定48 h、脱水、包埋,切片,HE染色,后镜下观察各组肺的组织结构改变。
1.2.4 肺组织干湿比动物处死后,取下左侧肺叶,滤纸吸取肺表面的水分和血液后称质量,80 ℃烘箱内烘干24 h,再称质量,计算肺组织干湿比。
1.2.5 Western blotting检测肺组织NLRP-3和Caspase-1含量利用常规方法提取组织蛋白,BCA蛋白定量,取等量(50 μg)蛋白样品上样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶,电泳,转于PVDF膜,用含3% BSA的TBST室温封闭1 h,洗膜后加入鼠源性抗体,4 ℃孵育过夜。次日以TBST溶液洗膜,然后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体于37 ℃摇床孵育1 h,洗膜后以免疫印迹化学发光显影,对比NR和HR肺组织中NLRP-3和Caspase-1的含量。
1.2.6 肺组织中NLRP3和Caspase-1的RT-PCR检测取约100 mg肺组织加入1 mL trizol裂解液,高通量组织研磨机研磨1 200 r/min × 4 min,4 ℃离心10 min取上清液,参照试剂盒的要求提取肺细胞RNA,紫外分光光度仪检测RNA的吸光度(A)值,A260/A280确定RNA的纯度,选择A260/A280 在1.8~2.0的RNA样品进行反转录;提取的RNA保存于-80 ℃ 超低温冰箱中,或立即用于逆转录。按反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行扩增。引物资料见表 1,PCR反应条件:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性20 s,NLRP3和IL-1β退火温度为59 ℃均20 s、72 ℃ 20 s延伸,循环40 次,72 ℃延伸5 min。比较NLRP-3、IL-1β在NR和HR中的表达。引物序列见表 1。
引物名称 | 序列 | 长度(bp) | 退火T(℃) |
NLRP3 | F:GACCAGGTTCAGTGTGTTTT | 115 | 59 |
NLRP3 | R:GGTTGGTGCTTAGACTTGAG | 115 | 59 |
IL-1β | F: CTTCAAATCTCACAGCAGCATC | 170 | 59 |
IL-1β | R: GCTGTCTAATGGGAACATCACA | 170 | 59 |
GAPDH | F:AACTTTGGCATTGTGGAAGG | 132 | 59 |
GAPDH | R:GGATGCAGGGATGATGTTCT | 132 | 59 |
采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,以p<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 肺组织HE染色结果Sham 组肺组织结构无炎症细胞浸润,毛细血管无扩张及充血,肺泡壁无增厚;NR组肺泡结构紊乱,肺泡上皮肿胀,毛细血管扩张充血,肺泡间质和肺泡内见炎症细胞、蛋白渗出,为急性肺损伤的病理改变;与NR组比较,HR组肺泡渗出明显减少,间质水肿明显减轻(图 1)。
2.2 肺组织干湿质量比的比较各组大鼠在给予液体复苏后4 h,以湿干质量比法测定肺组织中含水量,以了解肺组织的水肿程度。结果表明,HR组(5.850±0.102)低于NR组(6.471±0.166),p<0.05;Sham组(4.592±0.099)低于HR组,p<0.05,差异具有统计学意义。
2.3 Western blotting检测肺组织NLRP-3和Caspase-1含量各组大鼠给予液体复苏后,HR组炎症小体NLRP3蛋白表达显著低于NR组。Caspase-1蛋白表达HR组显著低于NR组,但两者均高于sham组(图 2)。
2.4 肺组织中NLRP-3和IL-1βmRNA的表达肺组织中NLRP-3 mRNA的表达HR组(1.027±0.143)低于NR组(1.349 ±0.163)(p<0.05)。肺组织中IL-1β mRNA 的表达HR组(1.623±0.125)低于NR组(2.388±0.229)(p<0.05)(图 3)。
3 讨论多种直接损伤因素和继发外部因素均可引起ALI,其中HS是重要的肺外因素之一。HS诱发ALI-ARDS-MODS等一系列并发症的发生发展,最终增加HS患者的病死率[9, 10]。ALI常伴有中性粒细胞、巨噬细胞等多种炎症细胞的激活以及TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎症介质的释放,导致肺泡-毛细血管膜的弥漫性损伤,因此ALI的病理特征主要表现为肺水肿与炎症反应,其中,IL-1β扮演着重要的角色[11]。肺血管内皮细胞不仅是IL-1β的重要来源细胞,也是其作用的靶细胞。当IL-1β被激活后,肺血管内皮细胞与IL-1β之间的恶性循环,会导致其他炎症介质的激活与释放,进一步加重ALI。研究发现,炎症小体效应蛋白Caspase-1在IL-1β的活化过程中发挥了重要作用,非活化的IL-1β前体通过Caspase-1的裂解才能活化成为成熟的IL-1β[12]。
HS时的组织低灌注状态容易引发组织缺血、缺氧,液体复苏可增加机体血容量和组织灌注,而再灌注产生大量的ROS进一步促发组织炎症反应和细胞凋亡。ROS是炎症小体强的激活物,因此,任何能够抑制ROS产生的措施都将从根本上减轻液体复苏过程中再灌注造成的损伤[13, 14]。相关研究表明治疗性低温可使氧解离曲线左移,减少细胞色素C电子转移和氧的结合,从而最终抑制ROS的产生 [15]。
本研究实验发现低温诱导的液体复苏能显著减弱肺脏组织毛细血管液体及中性粒细胞的渗出,有效减轻大鼠肺组织水肿及损伤,从而避免大鼠急性呼吸窘迫的发生。同样,通过对NR和HR干预下的HS大鼠肺组织炎症小体活化进行比较,结果提示治疗性低温诱导的液体复苏减弱炎症小体的活化,减轻Caspase-1的活化,使得IL-1β分泌减少。
综上所述,治疗性低温能够显著抑制HS大鼠液体复苏过程中炎症小体的活化,减少肺组织炎症介质IL-1β 等的产生,减轻肺组织水肿及损伤程度。然而,治疗性低温对HS大鼠其他病理生理指标的影响还有待进一步研究。
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