血管内皮细胞的激活与高通透性的活化状态是脓毒症炎症反应的特征性改变,可以导致血管屏障完整性的破坏进而引起血容量不足、组织水肿及各器官功能受损^{[1, 2]}。调节血管内皮细胞的通透性，避免炎症反应引起的血管内皮细胞损伤，是维持循环稳态和呼吸功能，保护脏器功能的关键^[3]。

乌司他丁(UTI)是存在于人尿液与血液中的一种糖蛋白，属于一种Kunitz型蛋白酶抑制剂，对体内多种酶有抑制作用，同时也是人体内一种天然的抗炎物质，可以抑制炎症介质的释放^{[4, 5, 6]} 。近年来UTI对脓毒症的临床疗效有多种推测和假说，有研究表明UTI可通过减轻脓毒症患者的免疫反应，可以缩短脓毒症患者住院时间，减少患者病死率,有望改善其预后^{[7, 8, 9]}。但目前仍未从细胞水平及分子机制角度来阐明其具体作用。为了探讨UTI是否直接通过对炎症状态下血管内皮细胞高通透性的改善而发挥其在脓毒症的抗炎作用,本实验以EA.hy926细胞为研究对象，分别以TNF-α和UTI作用于EA.hy926细胞，观察细胞通透性的改变以及相关因子的表达，以期明确UTI对血管内皮细胞通透性的影响及相关分子机制。

人脐静脉内皮细胞株EA.hy926(上海中国科学院细胞库)；乌司他丁(UTI)(广东天普生化医药股份有限公司,批号031309034)；RPMI-1640细胞培养基及胎牛血清(美国Hyclone公司)；重组人肿瘤坏死因子(TNF-α)、免疫组化试剂盒及DAB显影液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；TRIzol试剂、逆转录反应试剂盒及PCR扩增试剂盒(大连TaKaRa宝生物工程有限公司)；Millicell ERS-2电阻仪及Transwell小室(美国Millipore公司)。

将EA.hy926细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、 5％ CO₂恒温孵箱中培养，每2 d更换一次培养液，根据细胞生长情况进行传代。

将EA.hy926细胞以10⁴个/孔接种于96孔板内，充分摇匀，置于恒温孵箱中培养48 h，用不同浓度UTI(1、10、100、1 000 U/mL)分别作用24 h后，每孔加入MTT 20 μL，培养4 h，再加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μL，避光，室温摇床上作用15 min，酶标仪测定吸光度(A)值。

向Transwell小室的上下室均加入300 μL的1640培养液，将Millicell ERS-2电阻仪^[10]的两个电极分别置于滤膜表面及滤膜下，测量每个小室的基础电阻值，即空白电阻。将EA.hy926细胞以5×10⁴个/孔的密度均匀接种在各小室中，待其生长形成单层，上室加入不同浓度UTI(1、10、100、1 000 U/mL)作用1 h后加入TNF-α作用24 h。用同样的方法测各小室的电阻值。其单层细胞电阻值(单位：Ω/㎝²)=(所测电阻-空白电阻)×有效膜面积。

UTI预处理EA.hy926 细胞 1 h后，加入TNF-α再作用 24 h。应用 TRIzol 法提取细胞总RNA,严格按照反转录试剂盒说明书进行逆转录，VE-cadherin引物上游5’-CCACGCCTCTGTCATGTACC-3’，下游5’-GGTGAAAGCGTCCTGGTAGTC-3’；GAPDH上游5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGA-3’，下游5’-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3’，PCR 反应体系为：PCR rTaq酶 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，灭菌蒸馏水9.5 μL。反应条件为：94 ℃ 预变性5 min、变性30 s,58 ℃退火30 s以及72 ℃延伸30 s，共30个循环。扩增产物于1.5 %琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶电泳成像系统拍照，用Quantity One软件进行分析。

将EA.hy926细胞悬液以10⁴个/孔的密度进行细胞爬片，孵育24 h后PBS洗涤细胞3次，4 %多聚甲醛固定，按照SP法免疫组化试剂盒说明进行操作，DAB染色后，常规复染、脱水、透明，中性树胶封片，Olympus倒置显微镜下观察并采图，用Image-Pro Plus 6.0软件分析每个视野的平均吸光度值，以平均吸光度值衡量蛋白表达水平。并做统计学分析。

采用 SPSS 17.0 软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。采用GraphPad Prism 5作图。

与正常组相比，1、10和100 U/mL的UTI 对EA.hy926细胞活性无明显影响(均P＞0.05)，而1 000 U/mL的UTI对EA.hy926细胞活性有抑制作用(0.238±0.007)vs.(0.219±0.043)，P=0.014，见图 1。

与正常组细胞活性比较,1 000 U/mL UTI 组差异具有统计学意义，aP=0.014 图 1 UTI对EA.hy926细胞活性的影响 Fig 1 The effects of UTI on EA.hy926 cell viability

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与正常组相比，TNF-α组单层细胞电阻明显降低(67.200±8.937)vs.(33.600±8.771),P=0.010；1、10、100和1 000 U/mL的UTI均可改善TNF-α所致的单层细胞电阻值降低，其中T+U (10 U/mL)组和T+U (100 U/mL)组的细胞电阻值与TNF-α组比较，差异具有统计学意义(49.232±3.162)vs.(33.600±8.771),P=0.044；(63.700±8.515)vs.(33.600±8.771),P=0.013，见图 2。

与正常组单层细胞电阻比较，TNF-α组差异具有统计学意义，aP=0.010；与TNF-α组单层细胞比较，T+U (10 U/mL)和T+U (100 U/mL)组差异均有统计学意义，b(P=0.044，P=0.013) 图 2 UTI对TNF-α作用下EA.hy926细胞电阻值的影响 Fig 2 The effects of UTI on the transepithelial electrical resistance of EA.hy926 cell induced by TNF-α

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与正常组相比，TNF-α组VE-cadherin mRNA表达明显降低(1.089±0.018)vs.(0.835±0.021)，P=0.000；1、10、100和1 000 U/mL的UTI均能抑制TNF-α引起VE-cadherin mRNA的低表达，且在10 U/mL和100 U/mL浓度时较TNF-α组差异具有统计学意义[(0.976±0.014)vs.(0.835±0.021),t=9.777，P=0.001；(1.115±0.015)vs.(0.835±0.021),P=0.000]，见图 3。

与正常组VE-cadherin mRNA的表达比较，TNF-α组差异具有统计学意义，aP=0.000；与TNF-α组VE-cadherin mRNA的表达比较， T+U (10 U/mL)和T+U (100 U/mL)组差异均有统计学意义，bP=0.001，P=0.000 图 3 各组VE-cadherin mRNA表达的比较 Fig 3 The comparison of VE-cadherin mRNA expression between groups

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免疫细胞化学法检测VE-cadherin蛋白表达的结果显示，正常组中，VE-cadherin主要分布于细胞膜与细胞质，呈棕色，见图 4A；TNF-α作用下细胞间隙增大，VE-cadherin的表达明显减少(0.061±0.013)vs.(0.093±0.014)，P=0.049，呈浅棕色，见图 4B；UTI组、T+U组细胞间隙缩小，细胞紧密连接，见图 4C、D；与TNF-α组比较，T+U组VE-cadherin的表达明显增加(0.032±0.004)vs.(0.061±0.013)，P=0.016，见图 4D。

A：正常组；B： TNF-α组；C：UTI组；D：T+U组。箭头示细胞VE-cadherin蛋白的分布 图 4 VE-cadherin蛋白的细胞化学染色(×200) Fig 4 Immunocytochemistry staining of VE-cadherin in EA.hy926 cell(×200)

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本研究首次在体外细胞水平观察到UTI可通过改善炎症状态下细胞高通透性而达到调节血管稳态作用。研究发现TNF-α诱导的血管内皮细胞高通透性能够被UTI抑制，且在1～100 U/mL浓度范围呈现一定的剂量依赖性。

目前UTI对脓毒症的疗效已有较多研究报道，曾朝涛等^[11]研究发现UTI可通过减轻血脑屏障损伤，抑制脑细胞凋亡，对脓毒症大鼠脑组织起保护作用；同时有研究表明UTI在脓毒症早期对肠黏膜屏障有保护性作用^[12]。但UTI是否直接对血管内皮细胞有影响尚未有研究,其作用于内皮细胞的具体机制仍未有明确阐述。而且在体实验中，体内微环境复杂，影响因素较多，因此本实验采用离体人脐静脉内皮细胞进行对其作用机制进行探索，避免了众多因素的影响。

本研究首次发现在炎症状态下，UTI直接作用于血管内皮细胞，通过影响内皮细胞关键分子的表达，改善炎症状态时血管内皮的高通透性来达到其抗炎作用。以前的研究均表明UTI可能通过多种机制并存方式发挥其抗炎作用，如UTI可抑制机体炎症介质的释放，抑制白细胞过度激活，阻断细胞因子间的级联反应，从而来减轻全身炎症反应^{[8, 13, 14]}； Nakatani等^[15]研究结果也证实UTI可以抑制中性粒细胞介导的血管内皮损伤。本研究是对上述研究有益补充，从另一个角度证实了UTI对脓毒症中炎症反应有调节作用。

血管内皮钙黏蛋白VE-cadherin是血管内皮细胞特异性表达的黏附蛋白，是形成血管内皮黏附连接的关键成分。在炎症介质(如TNF-α)的作用下，细胞间VE-cadherin解聚和表达降低，从而使细胞间隙增大,血管内皮通透性增加^{[16, 17]}，本研究中VE-cadherin mRNA的变化与上述细胞通透性改变的结果一致，从而进一步证实了UTI通过改善血管内皮细胞高通透性而发挥其调节血管稳态的作用。

本研究证实1～1 000 U/mL浓度范围的UTI对炎症状态下血管内皮细胞高通透性有改善作用，而脓毒症时，一方面，机体产生多种炎症介质(如TNF-α、凝血酶、白细胞介素-1等)，这些炎症介质共同作用于血管内皮细胞，进而引起内皮细胞通透性的改变；另一方面，由于体内UTI可能通过多种间接途径影响脓毒症时炎症状态下血管内皮细胞的功能，因此脓毒症血管内皮细胞高通透性治疗作用的UTI浓度有待进一步探讨。

本研究还发现在1 000 U/mL UTI对TNF-α所致的血管内皮高通透性改善作用效果不如100 U/mL浓度时明显。细胞活性的检测结果表明1 000 U/mL UTI对正常细胞活性有抑制作用，因此笔者推测上述现象可能原因为高浓度的UTI对血管内皮细胞有一定的毒性作用。

综上，本研究探讨UTI通过对脓毒症中血管内皮细胞通透性紊乱的调节来发挥其维持微循环稳态作用。从分子生物学机制阐明UTI可抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞通透性增加，揭示UTI在危重症患者中的抗炎作用的新机制，为临床上治疗脓毒症探索新的可能及理论依据。