中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (12): 1420-1424
Beclin-1与LC3在胶质瘤细胞C6自噬中的相关性
赵建祥, 于荣国 , 王开宇, 龚书榕, 叶勇, 张颖蕊, 李小燕     
350001 福州,福建省立医院重症医学三科 福建医科大学省立临床学院(赵建祥、于荣国、王开宇、龚书榕、叶勇、张颖蕊);
福建医科大学附属协和医院病理科(李小燕)

组织细胞发生的自体吞噬简称自噬(autophagy),是广泛存在于真核细胞内的一种生理现象,贯穿于生物合成、代谢调节、生长发育及衰退老化的全过程[1]。自噬可在细胞所处的稳态环境发生变化时如饥饿、缺乏营养或线粒体功能障碍[2]等情况下被激活。

Beclin-1是第1个[3]被发现的在哺乳动物细胞内参与自噬的特异基因,与酵母自噬基因Atg6同源,是自噬发生的始动因子[4],能介导其他自噬蛋白定位于前自噬小体的关键因子;Beclin-1与Ⅲ型P13K及vps34结合形成复合体诱导自噬[5],是参与哺乳动物细胞内自噬体形成的关键调控蛋白[6]。目前在多种肿瘤中发现Beclin-1单等位基因的缺失或者蛋白表达下调,提示Beclin-1可能为抑癌基因[7]。LC3为微管相关蛋白轻链3,与酵母自噬基因Atg8同源,存在Ⅰ型与Ⅱ型两种不同分子质量形式[8];未发生自噬时,细胞内LC3经过加工,成为胞质可溶性LC3-Ⅰ;发生自噬时,LC3-Ⅰ被泛素样体系修饰和加工[9],与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)共轭结合[10],形成LC3-Ⅱ;LC3-Ⅱ结合并始终位于胞内自噬体膜上,被用作哺乳动物自噬体的标记蛋白[11];LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值与自噬强度成正比。

胶质瘤是常见的神经系统肿瘤,预后差。WHO划分胶质瘤为I~IV级,分级越高,恶性程度越高。已有研究表明,在胶质瘤细胞的侵袭性生长过程以及胶质瘤细胞对放化疗的反应中[12],肿瘤细胞的自噬发挥着重要作用[13];但关于Beclin-1和LC3在胶质瘤细胞中介导自噬的具体过程及相关机制尚未明确。在前期工作中[14],该研究将平衡盐系统(earle's balanced salts,EBSS)代替培养液处理大鼠胶质瘤细胞C6已成功构建饥饿诱导的自噬模型,通过透射电镜观察自噬体,Western blot及免疫荧光检测Beclin-1及LC3表达的变化,初步探讨了Beclin-1与LC3在自噬中的关系。该研究将通过检测Beclin-1基因下调前后大鼠胶质瘤细胞C6内Beclin-1及LC3的变化,进一步探讨二者在自噬发生过程中的相关性。

1 材料与方法 1.1 研究对象

大鼠胶质瘤细胞C6购自中国科学院上海生命科学院生化细胞研究所;细胞置于37 ℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,贴壁生长于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液中;用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化细胞,进行传代培养。对于需转染的细胞,将细胞接种于6孔培养板,当细胞融合度达到60% ~ 80%时,用于质粒转染实验。

1.2 实验试剂

pSilencer 3.1-H1质粒购自吉凯基因化学技术有限公司(上海,中国,图 1);大肠杆菌感受态细胞DH5α购自北京康为世纪生物科技有限公司;Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司(加利福尼亚,美国);细胞培养液EBSS购自Gibco公司(纽约,美国);PCR所用Beclin-1引物由生工生物工程(上海,中国)有限公司合成;TriPure Isolation Reagent购自Roche公司(巴塞尔,瑞士);2×Tap PCR Master Mix购自艾德莱生物科技有限公司(北京); Prime ScriptTM RT reagent kit购自宝生物工程有限公司(TaKaRa,大连,中国);MinElute GelExtract Kit,QIAprep Spin购自凯杰企业管理有限公司(上海,中国);Western blot所用一抗兔抗大鼠单克隆抗体Beclin-1,LC3,内参β-Actin均购自Santa Cruz公司(德克萨斯,美国);HRP标记的羊抗兔二抗购自碧云天公司(上海,中国)。

Bam HⅠ和HindⅢ为酶切位点,目的基因连接位置。 图 1 pSilencer 3.1-H1质粒图谱
1.3 实验方法 1.3.1 Beclin-1基因的PCR扩增

根据NCBI检索的Beclin-1基因序列(NM_003766.3)和pSilencer 3.1-H1表达质粒的多克隆酶切位点,利用软件Primer 5设计PCR引物:引物序列:

OLIGO 1 5'-GATCCGCGGAACTTGAACGAACGAATTCAAGAGATTCGTTCGTTCAAGTTCCGTTTTTTGGAAA-3';OLIGO 2 5'-AGCTTTTCCAACGGAACTTGAACGAACGAATCTCTTGAATTCGTTCGTTCAAGTTCCGCG-3'。以大鼠胶质瘤细胞C6总RNA为模板,用Prime ScriptTM RT reagent kit进行PCR扩增,条件为:95 ℃ 10 min;75 ℃ 10 min;55 ℃ 10 min;35 ℃ 10 min;15 ℃ 10 min;30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色。

1.3.2 PCR产物的扩增

将上述PCR产物以凝胶回收试剂盒纯化回收后,与pSilencer 3.1-H1载体连接,转化E coli-DH5α感受态细胞,抗氨苄霉素筛选;挑取白色菌落进行扩增,并用微量质粒抽提试剂盒提取质粒,获得的质粒用限制性内切酶HindⅢ和Bam HⅠ双酶切鉴定后,选取可疑重组子送上海博亚生物工程公司进行双向测序,并与NCBI数据库进行BLAST分析;重组子命名为pSilencer 3.1-Beclin-1-shRNA。

1.3.3 转染和稳定表达克隆的筛选

将C6细胞常规胰酶消化后,接种于6孔细胞培养板(每孔3×105个细胞),细胞融合度达60% ~ 80%时,进行质粒转染。转染具体操作步骤参照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂操作手册进行。转染48 h后,把培养皿中的培养液由不含血清DMEM换为含血清培养液后,继续培养24 h。实验分组如下:实验组为转染pSilencer 3.1-Beclin-1-shRNA质粒的C6细胞,采用饥饿法处理,予EBSS为培养液培养细胞12 h[12, 13, 14]。空载体组为转染pSilencer3.1空载质粒的C6细胞,饥饿处理方法同实验组;对照组为未干预的C6细胞,予10%胎牛血清,1%青链霉素的DMEM培养液培养细胞12 h。

1.3.4 细胞总蛋白提取

取处理后的各组C6细胞,PBS洗涤2次,洗净培养皿底液体后加入100 μl细胞裂解混合液RIPA(在使用前数分钟内加入1 μL PMSF,使PMSF的终浓度为1 mmol/L)。吹打使裂解液遍布培养皿底后,置于冰上10 min使其充分裂解,重复3次。用细胞刮刀仔细刮过皿底,将液体吸至离心管内,12 000 g离心15 min后吸取上清,即为细胞总蛋白。

1.3.5 Western Blot

取50 pg细胞总蛋白用5%SDS-PAGE凝胶进行浓缩后,经12%凝胶进行电泳分离,转入PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2h,按稀释浓度Beclin-1 1:200,LC3 1∶ 200,β-Actin 1∶ 1 000加入一抗,4 ℃孵育过夜,按稀释浓度1∶ 1 000加入HRP标记的二抗,室温孵育lh,TBST洗涤三次,参照ECL Plus化学发光试剂盒使用说明加入发光剂,将PVDF膜置于ImageQuant LAS 4000超灵敏化学发光成像仪(GE公司,美国)进行成像分析,观察各实验分组Beclin-1,LC3与β-Actin的光密度差异。每项分组均独立进行5次Western Blot检测。

1.4 统计学方法

Western blot结果以显影条带的净光密度值表示蛋白表达量,分别计算目的蛋白Beclin-1,LC3与内参蛋白β-Actin比值进行相对定量分析。统计各分组光密度比值呈正态分布,以均数±标准差(x±s)表示;用SPSS 19.0统计软件进行分析,多组比较时,各数值总体方差齐,总体采用单因素方差分析,组间采用LSD-t检验;Beclin-1与LC3蛋白表达的相关性采用Pearson 相关分析;以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 测序法鉴定重组质粒

挑选阳性转化子经Chromas MFC Application软件进行测序,结果显示实际测序结果与目标基因Beclin-1序列的identities值等于100%,说明重组质粒阳性转化子的基因序列与目标序列完全一致(图 2)。

直接测序结果显示重组质粒阳性转化子的基因序列与目标基因Beclin-1序列完全一致。 图 2 重组质粒pSilencer 3.1-Beclin-1-shRNA测序结果
2.2 WB检测转染后Beclin-1蛋白量变化

三个实验分组中,饥饿法处理的实验组C6细胞内Beclin-1蛋白表达水平趋近于对照组,明显低于饥饿法处理的空载体组,饥饿法处理的空载体组C6细胞内Beclin-1蛋白表达明显。说明pSilencer 3.1-Beclin-1-shRNA重组质粒顺利表达,干扰了C6细胞内Beclin-1基因表达(图 3),质粒转染成功。

直接测序结果显示重组质粒阳性转化子的基因序列与目标基因Beclin-1序列完全一致。 图 3 WB检测转染后Beclin-1蛋白量水平

对照组:未予干预的大鼠胶质瘤细胞C6;实验组:转染pSilencer 3.1-Beclin-1-shRNA质粒的大鼠胶质瘤细胞C6,再以饥饿法处理;空载体组:转染pSilencer 3.1质粒的大鼠胶质瘤细胞C6,再以饥饿法处理。实验组C6细胞内Beclin-1蛋白表达水平趋近于对照组 ,明显低于空载体组,说明干扰质粒顺利表达,下调了细胞内目的基因Beclin-1的水平。

2.3 WB检测Beclin-1下调后LC3蛋白量变化

三个实验分组中,饥饿法处理的实验组C6细胞内LC3蛋白表达水平趋近于对照组,明显低于饥饿法处理的空载体组,饥饿法处理的空载体组C6细胞内LC3蛋白表达明显,表达模式与Beclin-1一致(图 4)。同时将各组LC3蛋白表达水平与其对应组的Beclin-1蛋白水平相关性进行统计学分析,结果呈正相关(r=0.873,P<0.01)。

直接测序结果显示重组质粒阳性转化子的基因序列与目标基因Beclin-1序列完全一致。 图 4 WB检测Beclin-1下调后LC3蛋白水平

对照组:未行干预的大鼠胶质瘤细胞C6;实验组:转染pSilencer 3.1-Beclin-1-shRNA质粒的大鼠胶质瘤细胞C6,再以饥饿法处理;空载体组:转染pSilencer 3.1质粒的大鼠胶质瘤细胞C6,再以饥饿法处理。实验组C6细胞内LC3蛋白表达水平趋近于对照组,明显低于空载体组,说明LC3表达模式与Beclin-1一致。

3 讨论

适度的自噬可以使细胞在缺乏营养等恶性条件下维持生存[15],对机体有保护性作用[16],在许多疾病的形成过程中自噬发挥着重要的调节作用[17]。既往研究发现,多种肿瘤细胞内均存在自噬活性的改变[18],一方面,在肿瘤进展过程中因血供相对减少,刺激自噬在肿瘤细胞内启动,使得肿瘤对应激做出适应性反应而得以生存[19];另一方面,在前列腺癌,乳腺癌,卵巢癌及肝细胞癌中,存在Beclin-1基因表达下调或者缺失[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20];Liang等[21]将该基因导入人类乳腺癌细胞株MCF-7后,在细胞内观察到大量自噬空泡,且Beclin-1蛋白表达上调,由此证实Beclin-1是一种自噬诱导基因,被认为是一种抑癌基因。基于上述两种表现,有学者认为自噬在不同类型的肿瘤以及肿瘤形成的不同阶段,所扮演的角色可能不同[22, 23, 24],但其作用机制尚未完全明确。

自噬发生过程中,自噬体的形成是中心环节[3],LC3和Beclin-1与自噬体的形成密切相关,均为重要的自噬标志性分子[25],通过检测LC3含量可以判断自噬是被诱导还是被抑制,而检测Beclin-1表达水平则可以评估自噬活性的强弱程度。在前期工作中[14],该研究成功构建了饥饿诱导大鼠胶质瘤细胞C6发生自噬的模型,在自噬发生过程中,检测到Beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白表达水平上调,二者均在自噬发生的1 h开始出现蛋白表达,且Beclin-1的表达高峰出现在自噬发生的3 h,LC3-Ⅱ的表达高峰则迟于Beclin-1,出现在自噬发生的12 h,据此笔者推测,Beclin-1与LC3-Ⅱ之间可能存在某种相关性,由Beclin-1的表达介导了LC3-Ⅱ的形成。为了进一步验证此设想,该研究构建了pSilencer 3.1-Beclin-1-shRNA质粒,成功转染大鼠胶质 瘤细胞C6后,再以饥饿法诱导自噬发生,检测到在Beclin-1表达下调的同时,LC3的表达亦随之出现下调;而在空载体转染后以饥饿法诱导自噬发生的C6细胞中,检测到Beclin-1及LC3-Ⅱ的表达均出现上调,实验结果说明了Beclin-1及LC3-Ⅱ与自噬发生的密切正相关性,也从一定程度上提示了Beclin-1可能通过调节LC3-Ⅱ的表达发挥其在自噬中的相应作用。

但关于Beclin-1与LC3-Ⅱ之间的调节是直接相关抑或间接进行,以及Beclin-1与LC3-Ⅱ的表达水平变化对于大鼠胶质瘤细胞C6生物学行为的具体影响,在后续的实验计划中拟解决的问题仍存在许多,例如Beclin-1与LC3-Ⅱ之间调节路径的检测与验证,干预Beclin-1与LC3-Ⅱ的表达后检测C6细胞增殖能力、迁移能力、凋亡速率及周期进程的改变等,以此更深入揭示Beclin-1与LC3-Ⅱ在胶质瘤细胞自噬过程中的相关性,使二者在自噬调控中的作用机制进一步明朗化,并期待自噬活性的调节能够成为肿瘤治疗的新靶点[26]

参考文献
[1] Ryter SW, Choi AM. Autophagy in the lung [J]. Proc Am Tborac Soc, 2010, 7(1): 13-21.
[2] Gustafsson AB, Gottlieb RA. Autophagy in ischemic heart disease[J]. Circulation Research, 2009, 104(2): 150-158.
[3] 黄河清, 周祥, 陈建昌, 等. 吸烟对大鼠心肌组织自噬相关基因及蛋白表达的影响 [J]. 临床心血管病杂志, 2013, 29(9): 702-704.
[4] Kang R, Zeh HJ, Itze MT. The Beclin1 network regulates autophagy and apoptosis [J]. Cell Death Differ, 2011, l8(4): 571-580.
[5] Funderburk SF, Wang QJ, Yue Z. The Beclin 1-VPS34 complex at the crossroads of autophagy and beyond [J]. Trends Cell Biol, 2010, 20(6):355-362.
[6] Clarke J, Butowski N, Chang S. Recent advances in therapy for glioblastoma. Arch Neurol [J], 2010, 67(3): 279-283.
[7] 曹双双, 苏安平, 胡伟明, 等. Bcl-2和Beclin-1在胰腺癌中的表达及其相关性分析 [J]. 四川大学学报(医学版), 2012, 43(2): 156-160.
[8] 朱伟荣, 叶伟, 李春海. 饥饿诱导对纤维环细胞自噬因子LC3和Beclin-1-表达的影响 [J]. 中华实验外科杂志, 2011, 28(6): 983-985.
[9] 陆件, 钱会银, 刘励军, 等. 亚低温对心肺复苏大鼠海马神经细胞活性氧及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和自噬相关蛋白轻链3的影响 [J]. 中华急诊医学杂志, 2014, 6(23): 635-641.
[10] Ravikumar B, Sarkar S, Davies J E, et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology [J]. Physiol Rev, 2010, 90(4): 1383-1435.
[11] NiH, GongY, Yan JZ, et al. Autophagy inhibitor 3-methyladenine regulates the expression of LC3, Beclin-1 and ZnTs in rat cerebral cortex following recurrent neonatal seizures [J]. World J Emerg Med, 2010, 1(3): 216-223.
[12] Stipanuk MH. Macroautophagy and its role in nutrient homeostasis [J]. Nutr Rev, 2009, 67(12): 677-689.
[13] Brech A, Ahlquist T, Lothe RA, et al. Autophagy in tumor suppression and promotion [J]. Mol Oncol, 2009, 3(4): 366-375.
[14] 赵建祥, 贺华, 马建芳, 等. 饥饿诱导胶质瘤细胞自噬发生及Beclin-1表达的变化 [J]. 第二军医大学学报, 2010, (9): 933-936.
[15] 张霞, 李杰. 自噬在血液肿瘤中的研究进展[J]. 中国实验诊断学. 2015, 19(3): 511-513.
[16] Lu J, Shen Y, Qian HY, et al. Effects of mild hypothermia on the ROS and expression of caspase-3 mRNA and LC3 of hippocampus nerve cells in rats after cardiopulmonary resuscitation [J]. World J Emerg Med, 2014, 4(5): 298-305.
[17] 曾小云, 熊海霞, 李欣, 夏金明, 胡春林, 等. 激活自噬减轻心肺复苏后Wistar大鼠脑损伤[J]. 中华急诊医学杂志, 2013, 12(22): 1327-1332.
[18] Dikic I, Johansen T, Kirkin V. Selective autophagy in cancer development and therapy [J]. Cancer Res, 2010, 70(9): 3431-3434.
[19] 刘 艳, 刘中洋, 袭荣刚,等. 自噬与人类疾病最新研究进展[J]. 临床与实验病理学杂志, 2014 , 30(7): 771-773.
[20] Ding ZB, Shi YH, Zhou J, et al. Association of autophagy defeet with a malignant phenotype and poor prognosis of hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Res, 2008, 68(22): 9167-9175.
[21] Liang XH, Jackson S, Seaman M, et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin-1 [J]. Nature, 1999, 402(6762): 672-676.
[22] Jiang P, Mizushima N. Autophagy and human diseases [J]. Cell Research, 2014, 24(1): 69-79.
[23] White E. Deconvoluting the context-dependent role for autophagy in cancer [J]. Nat Rev Cancer, 2012, 12(6): 401-410.
[24] Janku F, McConkey DJ, Hong DS, et al. Autophagy as a target for anticancer therapy [J]. Nat Rev Clin Oncol, 2011, 8(9): 528-539.
[25] Niu TK, Cheng Y, Ren X, et al. Interaction of Beclin-1 with survivin regulates sensitivity of human glioma cells to TRAIL-induced apoptosis [J]. FEBS Lett, 2010, 84(16): 3519-3524.
[26] 程尼涛, 马立峰, 郭艾. 自噬与肿瘤研究现状[J]. 基础医学与临床, 2015, 35(3): 401-404.