2015, Vol. 24
脓毒症(sepsis)是感染因素所致的全身炎症反应综合征，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。脓毒症的发病机制极为复杂。研究发现，脓毒症主要是由凝血活化、炎症反应及纤溶抑制相互作用形成的级联反应过程，其中凝血活化是脓毒症发病的重要环节[1]。脓毒症时炎症反应可激活凝血系统；同时，生理性抗凝机制的抑制和下调纤维蛋白溶解，使血液处于高凝状态，微血栓形成造成微血管栓塞、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)，进一步发展可诱发严重脓毒症及脓毒性休克[2]。Gas6(growth arrest-specific protein 6)是血浆中依赖维生素K蛋白家族中最后发现的一个成员，是Gas6 基因编码产物。许多研究表明，Gas6具有后促进细胞增殖、对抗细胞凋亡、刺激细胞吞噬等作用[3, 4, 5]。近来大量文献报道Gas6对血小板活化及血栓稳定性具有重要作用[6, 7]。然而Gas6在脓毒症凝血功能异常中的作用尚不清楚。本实验通过建立小鼠CLP脓毒症模型，通过不同剂量的重组小鼠Gas6干预，24 h后检测小鼠凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fbg)、D-二聚体(DD)和血小板(PLT)计数,采用ELISA 检测血浆组织因子(TF )浓度、P选择素和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的变化,初步探讨Gas6蛋白对脓毒症小鼠凝血功能的影响。
1 材料与方法 1.1 主要试剂Recombinant Mouse Gas6(R&D公司，明尼阿波利斯，美国)，小鼠TF ELISA Kit (R&D公司，明尼阿波利斯，美国)，小鼠P选择素(P-Selectin)ELISAKit(岚派生物科技有限公司，上海，中国) ，小鼠细胞间黏附分子-1(ICAM-1)ELISAKit(岚派生物科技有限公司，上海，中国)。
1.2 动物模型制备小鼠脓毒症模型采用目前公认的与临床相关性较强的CLP(cecal ligation and puncture)脓毒症模型。清洁级小鼠禁食1 d，自由饮水，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后采用正中切口2～3 cm，3-0 丝线在血管弓结扎末端20%盲肠，20号针头穿透结扎线远端盲肠的两侧肠壁，使肠内容物少量自穿刺孔溢出，将盲肠还纳回腹腔，用 1-0 丝线逐层缝合关腹，术毕立即皮下注射1 mL生理盐水液体复苏。假手术组只开腹、牵引盲肠、复位、关腹、复苏，但盲肠既不结扎，也不穿孔。
1.3 动物分组与给药健康雄性清洁级BALB/c小鼠60 只，体质量20～25 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,，生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002。小鼠饲养及动物实验在温州医科大学实验动物中心进行，使用许可证号：SYXK (浙)2010.0150。将120 只BALB/c小鼠随机分为假手术组、CLP脓毒症组、CLP脓毒症+生理盐水组、CLP脓毒症+Gas6(1 μg)组、CLP脓毒症+Gas6(3 μg)组和CLP脓毒症+Gas6(6 μg)组，每组20 只。CLP脓毒症+生理盐水组在造模后尾静脉注射100 μL生理盐水，CLP脓毒症+Gas6(1、3、6 μg)组则是在造模后分别在尾静脉注入用生理盐水稀释不同剂量的rmGas6成100 μL的Gas6溶液。
1.4 标本采集及检测小鼠经过不同处理后于24 h后分别用眼眶静脉丛采血器行眼眶后静脉窦采血，采集完后置于含有0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝液的EP管中，轻轻颠倒混匀，3 000 r/min离心15 min，收集上层液(血浆，黄色)。采用凝血四项分析仪 (STA Compact CT )检测小鼠凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fbg)，血常规分析仪行血小板(PLT)计数。采用酶联免疫荧光定量法测定D-二聚体(DD)。按照ELISA试剂盒说明书操作检测小鼠血标本组织因子(TF)浓度、P选择素和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)。
1.5 统计学方法统计学方法采用SPSS 18.0统计软件，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，假手术组和CLP模型组比较用独立样本t检验，Gas6干预组和生理盐水组比较采用单因素方差分析和Bonferroni检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 rmGas6蛋白对脓毒症小鼠凝血功能的影响造模后1 d脓毒症小鼠凝血功能变化，见表 1。与假手术组相比较，CLP组PT(19.4±0.3)、TT(19.1±0.4)、APTT(37.1±1.1)均延长，DD(2.1±0.3)增加，Fbg(1.7±0.3)和PLT(122.3±4.2)减少(P＜0.01)。不同剂量Gas6对脓毒症小鼠凝血四项及血小板的影响，见表 2。与CLP+生理盐水组比较，Gas6蛋白干预组PT、TT、APTT均延长，DD增高，Fbg和PLT增高(P＜0.01)。与Gas6 1 μg组比较，Gas6 3 μg组PT、APTT延长(P＜0.01)，而TT(P=0.0749)、Fbg(P=0.99)、PLT(P=0.99)、DD(P=0.3265)差异无统计学意义。与Gas6 3 μg组比较，Gas6 6 μg组PT、TT、PLT升高或延长(P＜0.01)，APTT减小(P=0.001)，而Fbg和DD差异无统计学意义(P＞0.05)。与Gas6 1 μg组相比，Gas6 6 μg组APTT(P=0.097)、PT(P=0.0001)、TT(P=0.029)、PLT(P=0.000)增高和延长，而DD(P=0.99)、Fbg(P=0.279)差异无统计学意义。
| (x±s，n=6) | ||||||
| 组别 | PT(s) | TT(s) | APTT(s) | Fbg(g/L) | PLT(×109 L-1) | DD(mg/L) |
| 假手术组 | 11.3±0.5 | 14.2±0.2 | 25.1±0.7 | 3.1±0.2 | 190.3±5.9 | 0.7±0.2 |
| CLP组 | 19.4±0.3a | 19.1±0.4a | 37.1±1.1a | 1.7±0.3a | 122.3±4.2a | 2.1±0.3a |
| t值 | -43.933 | -30.006 | 25.202 | 10.634 | 25.714 | -10.634 |
| P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| 注：与假手术组比较，aP＜0.01 | ||||||
| (x±s，n=6) | ||||||
| 组别 | PT(s) | TT(s) | APTT(s) | Fbg(g/L) | PLT(×109 L-1) | DD(mg/L) |
| CLP+生理盐水组 | 20.2±0.4 | 20.2±0.3 | 35.1±0.7 | 2.1±0.4 | 132.2±4.4 | 2.1±0.2 |
| CLP+Gas6 1 μg | 27.2±0.2a | 26.1±0.6a | 41.7±0.6a | 2.6±0.3a | 141.2±2.1a | 2.6±0.1a |
| CLP+Gas6 3 μg | 32.1±0.2a | 25.1±1.2a | 45.1±1.2a | 2.8±0.2a | 142.6±4.5a | 2.9±0.3a |
| CLP+Gas6 6 μg | 34.1±0.5a | 27.5±0.6a | 43.2±0.5a | 2.9±0.1a | 156.3±3.3a | 2.8±0.4a |
| F值 | 495.9 | 134.3 | 223.0 | 12.67 | 54.07 | 10.75 |
| P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.0002 |
| 注：与CLP+生理盐水组相比，aP＜0.01 | ||||||
ELISA检测各组小鼠血浆组织因子(TF)浓度见图 1，与假手术组相比较，CLP脓毒症组IF浓度升高明显(t=－17.37,P=0.000)。与CLP+生理盐水组比较，Gas6干预组组织因子上升明显(F=10.82,P=0.0002)。与Gas6 1 μg组相比，Gas6 3 μg组TF值差异无统计学意义(P=0.99),与Gas6 3 μg组相比，Gas6 6 μg组TF值差异无统计学意义(P=0.99)，与Gas6 1 μg组相比，Gas6 6 μg组TF值差异无统计学意义(P=0.148)。
 |
| 与sham(假手术组)比较，aP＜0.01；与CLP+生理盐水(vehicle)组比较，bP＜0.01 图 1 rmGas6蛋白对脓毒症小鼠血浆组织因子(TF)的影响 Fig 1 Effects of rmGas6 protein on TF in septic mice |
ELISA检测各组小鼠血浆P选择素(P-selectin)见图 2，与假手术组相比较，CLP组P 选择素升高明显(t=-4.683,P=0.001)。与CLP+ 生理盐水组比较，Gas6干预组P选择素上升明显(F=8.173,P=0.001)。与Gas6 1 μg组相比，Gas6 3 μg组P选择素值差异无统计学意义(P=0.99),与Gas6 3 μg组相比，Gas6 6 μg组P选择素值差异无统计学意义(P=0.99)，与Gas6 1 μg组相比，Gas6 6 μg组P选择素值差异无统计学意义(P=0.99)。
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| 与sham(假手术组)比较，aP＜0.01；与CLP+生理盐水(vehicle)组比较，bP＜0.05 图 2 rmGas6蛋白对脓毒症小鼠血浆P选择素(P-selectin)的影响 Fig 2 Effects of rmGas6 protein on P-selectin in septic mice |
ELISA检测各组小鼠血清细胞间黏附分子-1(ICAM-1)见图 3，与假手术组相比较，CLP组ICAM-1升高明显(t=－6.33,P=0.000)。与CLP+生理盐水组比较，Gas6干预组ICAM-1上升明显(F=9.384,P=0.0004)。与Gas6 1 μg组相比，Gas6 3 μg组ICAM-1值差异无统计学意义(P=0.99),与Gas6 3 μg组相比，Gas6 6 μg组ICAM-1值差异无统计学意义(P=0.99)，与Gas6 1 μg组相比，Gas6 6 μg组ICAM-1值差异无统计学意义(P=0.99)。
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| 与sham(假手术组)比较，aP＜0.01；与CLP+生理盐水(vehicle)组比较，bP＜0.01 图 3 rmGas6蛋白对脓毒症小鼠血浆细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的影响 Fig 3 Effects of rmGas6 protein on ICAM-1 in septic mice |
凝血系统功能正常是机体凝血与抗凝血平衡的基础。凝血系统被激活后可产生高浓度凝血酶，这是维持凝血的关键，但产生的凝血酶也同时激活了抗凝系统和纤溶系统，以维持新的凝血与抗凝平衡。凝血功能障碍在脓毒症中经常发生[8]。在严重脓毒症中，机体凝血纤溶系统的异常可导致弥漫性血管内凝血(DIC)、微血管内血栓形成、灌注不足，最终引起多器官功能衰竭(MODS)和死亡[9]。研究表明，脓毒症患者病死率约18%～30%，脓毒症并发DIC患者病死率上升到35%[10]。凝血功能异常贯穿了整个脓毒症病程，脓毒症早期促发凝血亢进和DIC 发生，随后出现凝血因子消耗和纤溶的激活[11]。凝血系统在脓毒症的发病过程中起着重要作用，它与炎症反应相互促进、共同构成脓毒症发生、发展中的关键因素[12]。内毒素和TNF通过诱发巨噬细胞和内皮细胞释放组织因子，可激活外源性凝血途径，被内毒素激活的凝血因子XⅡ也可进一步激活内源性凝血途径，最终导致弥漫性血管内凝血(DIC)。
本实验采用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法制备脓毒症模型，这是目前公认的与临床相关性较强的脓毒症模型[13]。造模后，在内毒素或内毒素样物质的作用下，机体中性粒细胞、单核巨噬细胞、血管内皮发生复杂的免疫网络反应，释放出大量的内源性炎症介质，激活凝血系统，导致凝血功能紊乱。在脓毒症发展过程中，血小板(PLT)、凝血四项、DD与脓毒症病情严重程度显著相关[14, 15]。血小板(PLT)在脓毒症早期出现显著降低，并随着病情的进展发生改变。脓毒症并发弥散性血管内凝血可使PLT消耗，PLT的进行性降低是病情严重恶化、预后凶险的征兆[16]。Gando[17]等研究表明，脓毒症患者的凝血途径被激活，促使凝血酶和Fb 形成；同时，激活的纤溶激酶，对交联Fb进行降解，使DD大量产生。本次研究结果显示，CLP脓毒症组小鼠24hAPTT 、PT、TT、DD显著延长或升高；而PLT、Fbg都有不同程度减少。由此可见CLP脓毒症小鼠凝血功能异常，凝血因子消耗，APTT 、PT、TT的延长，PLT、Fbg 降低；纤维蛋白形成增加的同时，纤溶激酶激活，对交联后的 Fb 进行降解，D-二聚体水平升高。显示脓毒症存在凝血亢进、血栓形成而参与 DIC的过程。
脓毒症凝血异常主要以外源性途径异常为主，而组织因子(TF)是启动这一途径的关键凝血因子[18]。血管外层的平滑肌细胞、成纤维细胞、周细胞、星形细胞、足状突细胞等不与血液直接接触的组织细胞，可恒定表达TF，一旦血管壁损伤，组织因子释放。IF可通过Ca2+形成TF-Ca2+-Ⅻ复合物，FⅦ则被激活为FⅦa，于是外源性凝血系统被激活，从而启动凝血系统。本实验结果显示，CLP造模后24 h，血液中的TF浓度便显著升高，说明循环中各种效应细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、VEC)在炎症因子或介质刺激下激活而产生大量的TF，从而激活了凝血系统。在脓毒症发病过程中，内皮细胞对凝血功能的调节具有重要作用[19]。P-选择素和ICAM-1都与血管内皮活化有关，P-选择素主要介导粒细胞和单核细胞在内皮细胞表面的滚动、粒细胞和单核细胞与血小板的黏附，ICAM-1可介导单核细胞与内皮细胞的黏附促进炎症的发展。本实验结果CLP 24 h后小鼠血浆P-选择素和ICAM-1都是升高的，表明血管内皮细胞活化,激活凝血系统加重凝血反应。
生长停滞特异基因6(growth arrest-specific gene6，Gas6)蛋白是由Gas6基因编码的，与蛋白S 44%同源，它是依赖维生素K蛋白家族中的一员。Gas6蛋白在许多细胞中都有表达，如内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、骨髓细胞[20]。已有大量研究发现Gas6蛋白与Gas6受体TAM(Tyro3、Axl、Mer)相互作用，促进血小板的活化和稳定[20, 21]。Cosemans等[21]研究发现人血浆Gas6蛋白与TAM相互作用，激活P13k，与ADP协同增强或延长Akt磷酸化，进一步活化aⅡbβ3，促进血小板聚集和稳定。而干扰Gas6-TAM途径可减少血小板聚集、血块回缩、组织因子表达。 Angelillo-Scherrer等[22]研究发现动静脉血栓的小鼠Gas6表达升高，而Gas6敲除的小鼠体内动静脉血栓发生率低，证实了Gas6促进血小板聚集的作用。又有文献报道Gas6能够调节组织因子的表达，血管内皮Gas6敲除的小鼠组织因子表达降低，而重组Gas6蛋白能上调降低的TF水平[23]。Gas6也可通过加强内皮细胞、血小板和白细胞的作用促进炎症反应[24]。在本次试验中，rmGas6蛋白能延长或升高脓毒症小鼠血浆PT、TT、APTT、Fbg、DD、TF、PLT、P-selectin、ICAM-1水平。本研究表明rmGas6可能通过活化血管内皮细胞，上调脓毒症小鼠组织因子水平，启动外源性凝血途径，进一步激活凝血系统，凝血系统激活后相应的抗凝系统也激活导致凝血-抗凝血平衡失调。血小板在rmGas6输入后是升高的，有可能是脓毒症DIC消耗血小板减少，也可能是血小板本身数量增加，促凝作用增强。综合以上结果分析得出Gas6蛋白可能通过活化血管内皮细胞，上调脓毒症小鼠IF水平进一步启动凝血系统加剧DIC的发展。如果敲除或干扰血小板上的TAM受体，阻断Gas6-TAM相互作用，理论上将减轻脓毒症小鼠凝血功能障碍，为脓毒症凝血功能紊乱的治疗提供新的靶点。
近来Gas6在脓毒症中的研究也越来越多，Ekman等[25]发现脓毒症患者血Gas6和sAxl显著升高，Gas6升高更明显。并且Gas6的值与脓毒症严重程度和病死率密切相关。Gas6与严重脓毒症患者多器官功能障碍密切相关，研究发现静脉注射Gas6蛋白后可降低脓毒症小鼠血清AST,ALT和LDH值，减少促炎因子IL-6、IL-17，降低脓毒症小鼠病死率，减轻肺组织病理损害[26]。可见Gas6具有减轻脓毒症多器官功能障碍的作用，而本文研究结果显示Gas6加剧脓毒症凝血功能障碍，这就需要我们进一步探讨Gas6在脓毒症中的作用机制。
综上所述，Gas6蛋白可能通过活化血管内皮细胞，上调脓毒症小鼠IF水平进一步激活凝血系统，加剧凝血功能障碍。然而Gas6对脓毒症凝血功能影响的确切机理有待进一步研究。
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