中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (11): 1227-1233
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曹天辉, 蒋磊, 康凯, 费东生, 潘尚哈, 金松根, 赵鸣雁. 青蒿琥酯上调血红素氧合酶-1对脓毒症小鼠急性肺损伤的作用研究[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(11): 1227-1233.
Cao Tianhui, Jiang Lei, Kang Kai, Fei Dongsheng, Pan Shangha, Jin Songgen, Zhao Mingyan. Protective effects of artesunate on septic lung injury in mice via modulation of heme oxygenase-1[J]. Chin J Emerg Med, 2015, 24(11): 1227-1233.
青蒿琥酯上调血红素氧合酶-1对脓毒症小鼠急性肺损伤的作用研究
曹天辉, 蒋磊, 康凯, 费东生, 潘尚哈, 金松根, 赵鸣雁     
150086 哈尔滨,哈尔滨医科大学附属第二医院CCU病房(曹天辉)；
哈尔滨医科大学附属第一医院ICU(蒋磊、康凯、费东生、潘尚哈、金松根、赵鸣雁)
收稿日期：2015-04-07
基金项目：国家自然科学基金(81171785)
通信作者：赵鸣雁，Email:13796118989@126.com
摘要：目的 探讨青蒿琥酯(artesunate, AS)能否上调血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)对脓毒症小鼠急性肺损伤(ALI)起到保护作用。 方法 本实验于哈尔滨医科大学附属第一医院外科中心实验室完成。60只雄性昆明小白鼠，随机(随机数字法)分为假手术组(Sham组，n=15)、模型组(CLP组，n=15)、青蒿琥酯干预组(AS+CLP组，n=15)和HO-1抑制剂组(AS+ ZnPP + CLP组，n=15)。采用改良盲肠结扎穿孔(CLP)法制备脓毒症模型，青蒿琥酯干预组，造模前2h经腹腔注射青蒿琥酯(15 mg/kg)，HO-1抑制剂ZnPP(40 μmol/kg)则在给予青蒿琥酯1 h后经腹腔注射，其余各组小鼠给予等体积生理盐水。于术后24 h处死小鼠，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清炎症介质(TNF-α、IL-6)变化情况。通过测定肺脏湿/干(W/D)质量比检测肺水肿情况，采用HE染色观察肺组织病理损伤情况。采用蛋白印迹以及免疫组化法检测肺组织HO-1的表达情况，并且通过蛋白印迹法检测HO-1的上游调节转录因子核因子E2相关因子2(Nrf-2)的表达情况。组间多重比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q (Student-Newman-Keuls)法，以P < 0.05为差异具有统计学意义。 结果 与Sham组比较，CLP组血清炎症介质TNF-α(pg/mL) (54.37±15.59 vs.627.45±117.03, P < 0.05)、IL-6 (pg/mL) (81.53±26.89 vs.898.52±222.78, P < 0.05) 释放增加，蛋白渗出明显，肺水肿(肺脏W/D比值：4.27±0.22 vs.6.78±0.73，P < 0.05)和肺脏病理损伤 (肺损伤评分：2.20±0.2 vs.13.25±2.67, P < 0.05) 均加重。肺组织中HO-1、Nrf-2蛋白表达含量增加(P < 0.05)。给予AS干预后，与CLP组比较，血清炎症介质TNF-α(pg/mL) (627.45±117.03 vs.307.88±72.33, P < 0.05)、IL-6(pg/mL) (898.52±222.78 vs.413.47±115.14, P < 0.05) 释放减少，蛋白渗出减少，肺水肿减轻(肺脏W/D比值：6.78±0.73 vs.5.05±0.61，P < 0.05)，肺脏病理损伤减轻(肺损伤评分：13.25±2.67 vs.4.95±1.46, P < 0.05)。肺组织HO-1、Nrf-2蛋白表达含量明显增加(P < 0.05)，而AS对于脓毒症小鼠肺组织的上述保护作用被HO-1抑制剂ZnPP所逆转，HO-1抑制剂组肺脏损伤情况与CLP组相当(肺损伤评分：12.15±2.95 vs.13.25±2.67, P>0.05;肺W/D比值：6.78±0.73 vs.6.29±0.82，P>0.05)。 结论 AS对脓毒症诱发的ALI小鼠具有保护作用，其作用通路可能与上调HO-1减轻肺组织炎症反应，继而减轻肺损伤有关。
关键词： 青蒿琥酯     血红素氧合酶-1     脓毒症     急性肺损伤    
Protective effects of artesunate on septic lung injury in mice via modulation of heme oxygenase-1
Cao Tianhui, Jiang Lei, Kang Kai, Fei Dongsheng, Pan Shangha, Jin Songgen, Zhao Mingyan     
CCU Department, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China
Corresponding author: Zhao Mingyan, Email: 13796118989@126.com
Abstract: Objective To investigate the effects of artesunate (AS) on septic lung injury in mice and to study the modulation of heme oxygenase-1(HO-1) in lung in order to clarify the mechanism of AS action. Methods Sixty male Kunming mice were randomly(random number) divided into four groups: Sham group (n=15), CLP group (n=15), AS+CLP group (n=15) and AS+ZnPP+CLP group (n=15). Cecal ligation and puncture (CLP) method was employed to induce septic lung injury. AS (15 mg/kg) was injected into the abdomen of mice 2 hours before the CLP procedures, and ZnPP IX, an inhibitor of HO-1, was intraperitoneally injected in dose of 40 μmol/kg 1 hour after the AS injection. The equivalent volume of normal saline was intraperitoneally injected instead in mice of Sham group and CLP group. The mice were sacrificed 24 hours after the CLP procedures. The TNF-α,IL-6 in serum were assayed by ELISA method. The lung injury score and wet/dry ratio were measured. The western blotting and immunohistochemistry methods were used to determine HO-1 protein expression in lung tissue. The protein level of nuclear factor-E2-related factor-2 (Nrf-2), an important transcriptional factor of HO-1 in lung tissue was also analyzed by western blotting. One-way analysis of variance (ANOVA) was used for comparisons among the groups, and SNK-q (Student-Newman-Keuls) test was performed for further comparison, and difference was statistically significant at P < 0.05. Results The TNF-α(pg/mL)(54.37±15.59 vs. 627.45±117.03, P < 0.05), IL-6(pg/mL) (81.53±26.89 vs. 898.52±222.78, P < 0.05) in serum was increased, and the lung protein exudation, pulmonary edema (wet/dry weight ratio: 4.27±0.22 vs. 6.78±0.73，P < 0.05), pulmonary pathology injury (lung injury score: 2.20±0.2 vs. 13.25±2.67, P < 0.05) were aggravated by CLP. The HO-1 and Nrf-2 were up-regulated in lung tissue in CLP group compared with the sham group (P < 0.05). After the intervention of AS, the HO-1 and Nrf-2 were further increased (P < 0.05), the TNF-α(pg/mL)(627.45±117.03 vs. 307.88±72.33, P < 0.05), IL-6(pg/mL) (898.52±222.78 vs. 413.47±115.14, P < 0.05) in serum, lung protein exudation, pulmonary edema (wet/dry weight ratio: 6.78±0.73 vs. 5.05±0.61，P < 0.05), pulmonary pathology injury (lung injury score: 13.25±2.67 vs. 4.95±1.46, P < 0.05) were attenuated compared with the CLP group. However, the protective role of AS in the septic lung injury in mice was partly reversed by ZnPP, and no significant difference was detected between the AS+CLP+ZnPP and CLP group (lung injury score: 12.15±2.95 vs. 13.25±2.67, P>0.05;wet/dry weight ratio:6.78±0.73 vs.6.29±0.82，P>0.05). Conclusions AS plays protective roles in septic lung injury, and it is attributed to limiting lung inflammation via up-regulation of HO-1.
Key words: Artesunate     Sepsis     Heme oxgenase-1     Acute lung injury    

脓毒症是目前全世界所面临的严峻医学问题，更是ICU患者死亡的重要原因。当脓毒症诱发机体出现脏器损伤时，肺脏是最先受累的重要器官。在许多引起急性肺损伤(ALI)的病理生理因素中，炎症反应的失控是重中之重。因此，当脓毒症诱发ALI发生时，能否在短时间内控制炎症进展成为脓毒症是治疗成功与否的关键[1]。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血红素分解和代谢的限速酶，其代谢产物包括一氧化碳(CO)、二价铁离子(Fe2+)和胆绿素。大量文献研究证实HO-1及其代谢产物具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用[2]。青蒿琥酯(artesunate,AS)是青蒿素类的衍生物，有研究发现青蒿琥酯对于脓毒症可以起到保护作用[3]。但是对于其具体作用机制以及通路的研究目前仍旧缺乏。基于以上原因，本研究采用改良盲肠结扎穿孔(CLP)法制备ALI模型，旨在观察AS能否通过上调HO-1对于脓毒症所诱发的ALI起到保护作用。

1 材料与方法 1.1 试剂

青蒿琥酯粉针剂购于桂林南药股份有限公司，HO-1抑制剂锌原卟啉IX(ZnPP IX)(Sigma，美国)，小鼠TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒购于蓝基生物科技有限公司，蛋白印迹和免疫组化抗体兔抗小鼠HO-1多克隆抗体、Nrf-2多克隆抗体以及β-actin抗体购于(Santa Cruz,美国),辣根过氧化酶羊抗兔IgG购于北京中杉金桥公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术研究所。

1.2 动物及分组方法

清洁级雄性昆明小白鼠，周龄8~10周，体质量18~22 g，由哈医大一院动物实验中心提供。小鼠试验前一周饲养于哈医大一院动物实验中心，控制饲养温度在20~25 ℃，湿度50%±5%。小鼠试验处死标准符合哈尔滨医科大学动物伦理学标准。60只昆明小白鼠随机分为假手术组(Sham组)、脓毒症组(CLP组)、青蒿琥酯干预组(AS+CLP组)和HO-1抑制剂组(AS+ZnPP+CLP组)，每组15只。青蒿琥酯粉剂先溶于碳酸氢钠，混匀后再溶于生理盐水中。青蒿琥酯干预组：术前2 h腹腔内注射青蒿琥酯15 mg/kg；HO-1抑制剂组：术前2 h腹腔内注射青蒿琥酯，1 h后再注射ZnPP溶液(40 μmol/kg)；Sham组与CLP组于上述时间点注射等体积生理盐水。

1.3 脓毒症模型的制备

小鼠术前12 h禁食，自由进水，戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。于腹正中线做长约1 cm切口，剪开腹膜、分离盲肠，用3-0丝线在距盲肠根部1/3处结扎，分别于盲肠近段和末端各穿一孔，挤出少许粪便于腹腔内，回纳盲肠，逐层缝合腹腔。术后立即给予小鼠背部皮下注射生理盐水1 mL以补充术中液体丢失[4]。Sham组仅做开腹，分离盲肠远端，但不结扎、不穿孔直接关腹。术后各组小鼠分笼饲养，不禁食禁水。

1.4 ELISA法检测各组小鼠24 h血清TNF-α、IL-6水平

造模后24 h眼球取血法收集小鼠血液1 mL，离心机3 000 r/min，离心10 min后取上清于-80 ℃冰箱保存。TNF-α、IL-6因子检测具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。

1.5 肺组织湿/干质量(W/D)比值测定

取右肺上叶，滤纸吸取表面水分和血液，电子天平秤湿质量(W)后放于60 ℃烘箱内烘干48 h后秤干质量(D)，计算W/D比。

1.6 蛋白印迹法检测HO-1、Nrf-2因子在肺脏的表达

取右肺下叶用于肺组织匀浆制备，提取并纯化蛋白。用BCA法进行蛋白定量，各取40 μg蛋白行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V、3 h电泳后，转入硝酸纤维素膜，用5%的脱脂奶粉(PBS稀释，pH 7.14)4 ℃封闭1 h后分别滴加HO-1、Nrf-2(抗体浓度1∶ 1 000)一抗过夜，次日应用辣根过氧化物酶标记的二抗(抗体浓度1∶ 2 000)孵育后显影，曝光后经图像分析系统分析蛋白条带。

1.7 免疫组化法检测肺脏HO-1的表达

取左上肺叶经10%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切为5 μm的切片后脱蜡，枸橼酸钠溶液抗原修复，过氧化氢封闭抗原10 min，PBS冲洗3次，兔抗小鼠HO-1多克隆抗体(1∶ 100稀释)4 ℃孵育过夜，次日滴加羊抗兔二抗，37 ℃温箱孵育1 h后，DAB法显色，苏木精复染，显微镜下观察肺脏HO-1表达情况，肺泡内皮细胞、上皮细胞胞质中染色为棕黄色具有阳性意义。

1.8 HE染色法检测肺脏病理损伤情况

取左下肺组织于10%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切为5 μm的切片行HE染色。光镜下观察肺泡、肺间质水肿情况，炎性细胞浸润程度，肺脏血管内出血与肺泡透明膜形成情况，以此进行肺损伤评分[5]，评分标准按：0分为无损伤、1分为轻度损伤( < 25%)、2分为中度损伤(25%~50%)、3分为重度损伤(50%~75%)、4分为极重度损伤(>75%)。

1.9 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，各组数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q(Student-Newman-Keuls)法，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 AS对脓毒症小鼠血清促炎因子的抑制作用

各组小鼠血清中TNF-α、IL-6表达情况(见表 1)，与Sham组比较，CLP组血清TNF-α、IL-6水平升高明显(P < 0.05)；与CLP组比较，AS干预组小鼠血清TNF-α、IL-6水平明显下降(P < 0.05),血清促炎因子释放得到抑制，而给予ZnPP抑制剂后，与AS干预组比较，AS对促炎因子释放的抑制作用明显减弱(P < 0.05)。

表 1 各组小鼠血清TNF-α、IL-6的质量浓度 Table 1 The levels of TNF-α and IL-6 in serum of mice in each group
(pg/mL,x±s,n=8)
组别 TNF-α IL-6
注：与Sham组比较，a P < 0.05；与CLP组比较，b P< 0.05
Sham组 54.37±15.59 81.53±26.89
CLP组 627.45±117.03a 898.52±222.78a
AS+CLP组 307.88±72.33b 413.47±115.14b
AS+ZnPP+CLP组 589.36±111.57a 811.23±193.37a
F值53.8033.42
P值 < 0.01 < 0.01
表选项
2.2 AS对于肺脏病理损伤的保护作用

HE染色后计算肺脏损伤评分，并测量肺组织W/D比值，对各组小鼠肺脏病理损伤情况进行评估(肺损伤评分和肺组织W/D比值见表 2、各组小鼠肺脏病理图片见图 1)。Sham组小鼠肺泡结构清晰，肺泡以及肺间质无水肿，肺泡内无透明膜形成，肺泡和肺间质无明显炎性细胞浸润。应用CLP法造模后，CLP组、AS干预组和HO-1抑制剂组均出现不同程度的肺损伤，其中CLP组肺损伤最为严重。CLP组肺组织炎性细胞浸润明显，肺泡、肺间质水肿，肺水含量增加，肺泡内透明膜形成，部分肺脏血管出现血栓。与CLP组比较，AS干预组肺组织损伤程度减轻(P < 0.05)，肺泡以及肺间质内肺水含量减少(P < 0.05)，炎性细胞浸润减轻，肺泡结构清晰，而给予ZnPP抑制剂后,与AS干预组比较，ZnPP抑制剂组肺组织损伤加重，肺泡炎性细胞浸润增加、肺泡以及肺间质水肿明显(P < 0.05)。

A：Sham组；B：CLP组；C：AS+CLP组；D：AS+ZnPP+CLP组 图 1 各组小鼠肺脏病理学改变(HE×200) Fig 1 The pathological changes of lung tissue of mice in each group with HE staining (HE×200)
图选项
表 2 各组小鼠肺组织病理损伤评分以及肺组织湿干质量比情况Table 2 The lung injury score and W/D ratio of lung tissue of mice in each group
(x±s,n=6)
组别肺损伤评分肺组织湿干质量比
注：与Sham组比较，a P < 0.05；与CLP组比较，b P < 0.05
Sham组2.20±0.21 4.27±0.22
CLP组13.25±2.67a 6.78±0.73a
AS+CLP组4.95±1.46b 5.05±0.61b
AS+ZnPP+CLP组12.15±2.95a 6.29±0.82a
F值38.9619.33
P值 < 0.01 < 0.01
表选项
2.3 HO-1蛋白在肺组织的表达情况

Sham组小鼠肺脏HO-1表达极低，CLP组小鼠肺脏HO-1蛋白表达略有增加(P < 0.05)；与CLP组比较，给予AS预处理后，HO-1蛋白含量明显增加(P < 0.05)，而给予HO-1抑制ZnPP后HO-1蛋白含量明显下降(P < 0.05)。见图 2。

A：Sham组；B：CLP组；C：AS+CLP组；D：AS+ZnPP+CLP组；与Sham组比较，a P < 0.05；与CLP组比较，b P < 0.05 图 2 HO-1在各组小鼠肺组织中表达情况 Fig 2 The expression of HO-1 protein in lung tissue of mice in each group
图选项
2.4 Nrf-2蛋白在各组小鼠肺脏的表达情况

Sham组小鼠肺脏Nrf-2表达很低，CLP组小鼠肺脏Nrf-2表达升高(P < 0.05)；与CLP组比较，给予AS预处理后，Nrf-2蛋白含量明显增加(P < 0.05)，与AS干预组比较；HO-1抑制剂组，ZnPP并没有明显抑制Nrf-2蛋白在肺脏的表达(P>0.05)。见图 3。

A：Sham组；B：CLP组；C：AS+CLP组；D：AS+ZnPP+CLP组；与Sham组比较，a P < 0.05；与CLP组比较，b P < 0.05 图 3 小鼠肺组织中Nrf-2蛋白表达情况 Fig 3 The expression of Nrf-2 protein in lung tissue of mice in each group
图选项
2.5 免疫组化法检测HO-1在肺组织表达情况

肺泡内皮细胞和上皮细胞胞质中棕黄色染色为阳性结果。 Sham组小鼠肺脏几乎无HO-1表达，CLP组小鼠肺脏HO-1表达有所增加；与CLP组比较，AS干预组小鼠肺脏HO-1表达明显增加，而给予ZnPP后，HO-1抑制剂组小鼠HO-1在肺脏的表达并无明显增加。见图 4。

A：Sham组；B：CLP组；C：AS+CLP组；D：AS+ZnPP+CLP组 图 4 免疫组化法检测HO-1在各组小鼠肺脏的表达(IHC×400) Fig 4 The expression of HO-1 in lung tissue of mice in each group detected by immunohistochemistry (IHC×400)
图选项
3 讨论

多种因素均可导致ALI和ARDS的发生，脓毒症更是其中的常见原因之一。脓毒症发生早期，内毒素与Toll样受体4 (TLR-4)结合，引起TNF-α的释放，TNF-α也被证实是促炎因子释放的始动因子。当脓毒症发生早期，促炎因子主要以TNF-α释放为主，TNF-α激活后可以进一步促进IL-1、IL-18等炎性因子的大量释放[6]。而当脓毒症进展至晚期阶段时，促炎因子的释放主要以IL-6为主。血清中IL-6水平的高低可作为感染严重程度的检测指标，同样血清中IL-6水平的高低与脓毒症的病死率呈正相关。因此，抑制TNF-α和IL-6的释放可以起到肺脏保护作用并且降低脓毒症小鼠的病死率[7, 8]。当ALI发生时，适当的促炎因子释放有利于调动机体的免疫反应，进而起到清除诱发机体感染的微生物的作用。然而当受损脏器中促炎因子过度释放时，抗炎与促炎反应便处于一种失衡状态，这种炎症反应的失衡又加速了炎症因子的瀑布样效应。所以当脓毒症诱发ALI发生时，促炎因子的过度表达、抗炎因子的免麻痹是肺脏炎性细胞过度浸润的主要原因[9]。

当机体发生感染、创伤、氧化应激、缺血-再灌注损伤等情况时，HO-1作为一种内源性活性酶，在受损器官中大量分布，能够对机体起到保护作用[10]。在脓毒症时，HO-1基因缺陷小鼠与野生株小鼠比较，病死率明显升高。当ALI/ARDS发生时，HO-1在肺脏的分布明显增加，HO-1主要通过作用于肺泡内皮细胞和巨噬细胞起到抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用。HO-1的上述作用机制不仅保护了ALI发生时的受损肺脏，而且也降低了脓毒症的病死率[11, 12]。当脓毒症诱发ALI时，可以在肺泡灌洗液(BALF)中检测到大量的HO-1蛋白，并且HO-1的表达随着肺损伤的加重而呈现递增的趋势。当脓毒症发生时，除了通过内源性方式诱导HO-1表达外，许多学者希望通过外源性物质诱导HO-1的表达，进而将受损脏器的伤害降至最低。而外源性方式诱导HO-1的生成主要有两种，一种为HO-1基因转染方式，另一种为药物诱导方式。对于前一种方式，有研究发现通过腺病毒转染介导HO-1基因表达可以抑制脂多糖(LPS)诱发的TNF-α、IL-6和IL-1β的释放[13]。同样，流感病毒诱发小鼠ALI发生时，腺病毒转染HO-1于小鼠体内可以减轻肺脏损伤。还有研究显示，当脓毒症发生时，将HO-1基因转染至HO-1缺陷小鼠体内，HO-1在小鼠肺脏内皮细胞的表达增加可以抑制BALF中性粒细胞刺激蛋白(MIP-2)的表达，从而减轻肺组织的炎症反应[14]。而当疾病发生时，人体内并不缺少HO-1，并且HO-1的表达会随疾病的进展有所上调。因此通过药物诱导方式促进体内HO-1的表达显得更为切实可行。在脓毒症诱发的各种脏器损伤中，关于药物诱导上调HO-1酶学表达的研究已有许多，Li等[15]就通过研究发现葛根素可以上调ALI小鼠肺组织中HO-1的表达，进而起到肺脏保护作用。

AS是青蒿素类的衍生物，因其给药方式多样、可溶性好、耐药率低、在重型疟疾和脑型疟疾的治疗地位不可替代。重型疟疾和脑型疟疾本身就是脓毒症的一种疾病体现，这为AS在脓毒症中的抗炎研究奠定了一定的理论基础。Li等[16]发现AS对于脓毒症小鼠具有保护作用，主要是通过抑制TLR-4和NF-κB炎症通路有关，而阻断TLR-4通路能够起到肺保护作用[17]。此外，AS除了具有一定的抗炎作用外，还具有一定的免疫调节作用，当机体出现炎症反应时，AS与抗菌素联合应用可以增强抗菌素的抗菌活性[18]。本研究发现，AS与葛根素一样，同样可以上调HO-1的表达，这为AS对于ALI的抗炎治疗与免疫调节作用寻找到了新的通路。至少可以部分说明，AS的上述作用与上调体内HO-1的表达有关。

本研究利用经典的CLP法成功复制了脓毒症诱发的ALI模型。通过对血清促炎因子TNF-α和IL-6的检测，证实了AS对于脓毒症小鼠具有一定的抗炎作用，通过对各组小鼠肺组织HE染色观察、病理损伤评分以及肺脏W/D比的计算证实了AS对于脓毒症诱发的ALI具有保护作用，这与先前研究结果相似[6]。为了深入研究AS的抗炎通路，本研究利用蛋白印迹以及免疫组化两种方法检测了小鼠肺组织中HO-1以及Nrf-2的表达情况，发现AS给药后肺组织中HO-1以及Nrf-2的表达明显升高，而AS的上述作用可以被HO-1酶活性的竞争性抑制剂ZnPP所抑制。由于仅仅输注了HO-1抑制剂ZnPP而并没有输注Nrf-2因子的抑制剂，所以利用蛋白印迹方法检测Nrf-2因子表达时可以发现，与AS干预组比较，HO-1抑制剂组中Nrf-2的表达并没有下降。这也证实了，ZnPP通过活性竞争的方式抑制了HO-1酶的活性，而并没有抑制其上游调节产物Nrf-2的活性。

当然，不论是通过内源性还是外源性方式诱导HO-1，HO-1的释放也需要通过其上游通路的激活，进而起到保护受损脏器的作用。HO-1的上游调节产物有很多，对HO-1释放起最主要作用的还是Nrf-2通路。这也是本研究检测Nrf-2因子的主要原因。Nrf-2是细胞氧化应激反应中的关键因子，在正常情况下，Nrf-2和细胞骨架相关蛋白Keap-1以二聚体的形式存在于细胞质中，这使得保护细胞的酶类和抗氧化物处于基础表达水平，细胞处于稳定状态。当机体处于应激状态时，外界氧化应激因子或亲核物质刺激后，Nrf-2和 Keap-1解离进入细胞核中，与抗氧化原件(ARE)结合，启动Nrf-2下游靶基因的转录[19]。Reddy等[20]研究显示，敲除小鼠肺泡上皮细胞内的Nrf-2基因可以加速ALI的进展，由此可见Nrf-2信号通路是ALI时保护肺脏的重要靶点。还有试验研究显示，切断Nrf-2通路可以阻断HO-1对于脓毒症时脏器的保护作用，而在敲除Nrf-2基因的小鼠中，额外的补充HO-1可以起到对于受损机体的保护作用。这说明HO-1的产生至少有一部分是依赖于Nrf-2通路的。

综上所述，本研究证实了青蒿琥酯对于脓毒症诱发ALI小鼠具有保护作用，首次提出了青蒿琥酯可以通过激活Nrf-2通路进而促进小鼠体内HO-1表达起到抗炎作用，这也为青蒿琥酯的抗炎作用提供了新的理论基础。当然青蒿琥酯对于脓毒症的保护作用也许还有其他通路，这需要在今后的试验中加以证实。同样青蒿琥酯上调HO-1后对于肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的保护是否是通过HO-1的下游代谢产物CO和胆绿素而起到作用也需要进一步证实。

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