中华急诊医学杂志  2015, Vol. 24 Issue (10): 1131-1134
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王艳华, 苏文利, 郝平, 朱文献, 邵伟怡, 钱龙杰, 王毅鑫. p55TNFR选择性淋巴毒素对大鼠缺血再灌注后心脏损伤的保护作用[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(10): 1131-1134.
Wang Yanhua, Su Wenli, Hao Ping, Zhu Wenxian, Shao Weiyi, Qian Longjie, Wang Yixin. Protection against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by a novel selective lymphotoxin binding p55TNFR[J]. Chin J Emerg Med, 2015, 24(10): 1131-1134.
p55TNFR选择性淋巴毒素对大鼠缺血再灌注后心脏损伤的保护作用
王艳华, 苏文利, 郝平, 朱文献, 邵伟怡, 钱龙杰, 王毅鑫     
200062 上海，上海中医药大学附属普陀医院急诊外科
收稿日期：2015-05-04
基金项目：上海市卫生计生系统重点专科建设项目 (ZK2012A35)
通信作者：王毅鑫，Email: wangyanhua1629@163.com
摘要： 目的 研究p55TNFR选择性淋巴毒素对缺血-再灌注后心脏损伤的保护作用，并探讨其作用机制。 方法 SD大鼠40只随机(随机数字法)分为4组，A组为假手术组，B组为大鼠心脏缺血-再灌注(I/R)模型组，C组为25 μg/(kg·d)野生型淋巴毒素(rhLTα)治疗组，D组为25 μg/(kg·d)p55TNFR选择性淋巴毒素(rhLTα-Q107E)治疗组。各组在制备I/R模型后微量泵持续24 h静脉滴注生理盐水或治疗药物，24 h后检测血浆中心肌酶谱(AST、LDH、CK)、氧化/抗氧化指标(SOD、MDA、GSH-Px)，硝基蓝四唑染色计算心肌梗死面积。 结果 大鼠心脏缺血-再灌注(I/R)模型心肌梗死面积显著增高，心肌酶谱指标、MDA较假手术组明显升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px则明显降低(P<0.05)。rhLTα-Q107E治疗组可逆转心肌缺血-再灌注后心肌酶谱指标、MDA的升高及SOD和GSH-Px的下降(P<0.05)，而野生型rhLTα治疗组的作用不明显(P>0.05)。 结论 p55TNFR选择性淋巴毒素对大鼠心脏缺血-再灌注后的急性心脏损伤具有保护作用，其机制可能通过直接清除氧自由基、增加内源性抗氧化酶系统的活力而发挥保护作用。
关键词： p55TNFR     缺血-再灌注     心脏损伤     氧化应激    
Protection against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by a novel selective lymphotoxin binding p55TNFR
Wang Yanhua, Su Wenli, Hao Ping, Zhu Wenxian, Shao Weiyi, Qian Longjie, Wang Yixin     
Department of Traumatic Surgery, Putuo Hospital Affiliated to TCM of Shanghai, Shanghai 200062, China.
Corresponding author: Wang Yixin, Email: wangyanhua1629@163.com
Abstract: Objective To investigate the effect ofanovel lymphotoxin with selectively binding to p55 tumor necrosis factor receptor (p55TNFR) on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats in order to explore the mechanism． Methods Atotal of 40 SD rats were randomly(random number) assigned into four groups (n=10 in each), namely sham operation group (group A), I/R group (group B), wild type rhLTα treatment group (group C), and p55TNFR selective rhLTα (rhLTα-Q107E) treatment group (group D). After I/R model rats were established, various therapeutic agents or saline were given by continuous intravenous infusion for 24hviaamicropump. After 24 hours of treatment, serum myocardial zymogram, such as aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK), as well as superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities were determined. Myocardial infarction size (MIS) was measured by nitro blue tetrazolium chloride (NBT) staining. Results Compared to sham operation group, MIS, AST, LDH, CK, MDA were increased, while the activities of SOD and GSH-Px were decreased. However, all the effects were significantly reversed by treatment with rhLTα-Q107E (P < 0.05) but not rhLTα (P > 0.05). Conclusions The rhLTα-Q107E playsarole in the protection against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by the mechanism of scavenging oxygen free radicals and increasing the activity of endogenous antioxidant system.
Key words: p55TNFR     Ischemia-reperfusion     Myocardial injury     Oxidative stress     

缺血-再灌注所致的多脏器损伤可严重影响着心肺复苏患者的存活率[1]。心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是指心肌组织在较长时间缺血后，恢复血液灌流后出现的严重的心肌损害，其可能机制为自由基增多、细胞内钙超载、微血管损伤和白细胞的作用所致[2, 3, 4]。再灌注时产生了大量氧自由基，炎症因子的释放，导致心肌细胞的凋亡和心肌细胞结构的损害[5, 6, 7]。淋巴毒素α(lymphotoxin-α，LTα)是TNF家族成员之一，与细胞表面受体p55(TNFR1)相结合发挥生物学作用。研究表明p55TNFR可介导炎症反应、细胞毒作用等多种生物学作用[8]。

本研究通过设计p55TNFR选择性淋巴毒素(rhLTα-Q107E)，在大鼠心脏缺血-再灌注模型中检测该突变体LTα-Q107E治疗后大鼠心肌组织中心肌酶谱和氧化/抗氧化指标以及心肌病理变化，评价其在体内对心肌缺血-再灌注损伤的防治作用。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

野生型淋巴毒素(rhLTα)和p55TNFR选择性淋巴毒素(rhLTα-Q107E)由本室制备和保存；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成科技有限公司。氯化硝基四氮唑蓝(nitro blue terazolium chloride，N-BT)购自国药集团化学试剂有限公司

1.2 动物实验 1.2.1 分组

健康雄性SD大鼠40只由第二军医大学实验动物中心提供，体质量(225.3±13.1)g。随机(随机数字法)分为4组：(A) 假手术对照组、(B) 大鼠心脏缺血-再灌注(I/R)模型组、(C) 野生型淋巴毒素(rhLTα)治疗组[25 μg/(kg·d)［和(D) p55TNFR选择性淋巴毒素(rhLTα-Q107E)治疗组［25 μg/(kg·d)]，每组10只，各组间平均体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2.2 造模

大鼠用10％水合氯醛腹腔麻醉成功后进行手术。A组大鼠行单侧膝关节切开术作为假手术对照，B~D组大鼠用3/0医用单丝线穿过冠状动脉，在结扎线下垫聚乙烯管，结扎缝线缺血30 min，剪断缝线再灌注120 min，建立大鼠心脏缺血-再灌注(I/R)模型组。

1.2.3 处理与采样

各组在制备I/R模型后，微量泵持续24 h静脉滴注生理盐水或治疗药物，其中A组和B组静注生理盐水，C组和D组分别静注野生型rhLTTα和rhLTα-Q107E[(25 μg/(kg·d)]，术后24h分别采集血样和心脏组织标本。

1.3 动物实验样本检测 1.3.1 心肌酶谱检测

取血后，按试剂盒说明书方法对血清中天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)的活性进行检测。

1.3.2 心肌梗塞面积的测定

于不同时间点取出各组大鼠的心脏组织，4 ℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，剪取左心室，将左心室均匀地横断切成5片，置于硝基四氮唑蓝(N-BT)染色液中常温避光染色15 min，扫描染色后的切片。使用医学图像分析系统测量每片心肌双侧的梗塞区(即N-BT非染色区)与非梗塞区(N-BT染色区)。计算每片心肌的面积、心室总面积和梗塞区总面积；计算梗塞区占心室面积以及占全心面积的百分比。

1.3.3 SOD及MDA的检测

于不同时间点取出各组大鼠的心脏组织，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，剪取左心室，以生理盐水制成匀浆，3500 r/min离心10min，取适量上清液，按试剂盒说明书方法对MDA、SOD和GSH-Px水平进行测定。总蛋白量测定采用BCA法。

1.4 统计学方法

每个实验重复3～4次，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，数据采用SPSS 17.0软件处理，与对照组之间的比较用成组t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 LTα-Q107E突变体的构建及其与TNFR结合能力的差异

首先通过计算机分子模拟技术，模拟LTα与p55TNFR、p75TNFR的相互作用，设计了一系列LTα突变体。通过基因工程技术进行LTα的突变研究，发现LTα序列106-113位Loop结构是LTα与其受体p55TNFR、p75TNFR作用紧密但有差异的结构区域。通过几种方式验证发现LTα-Q107E突变体保持了结合p55TNFR的能力，而与p75TNFR几乎不结合，见表 1。

表 1 野生型和p55TNFR选择性LTα于受体的亲和常数测定结果 Table 1 Results of receptor affinity constant determination to wild type rhLTα and p55TNFR selective rhLTα
Interactionkaa (1/Ms)k·db (1/s)KDc (nmol/L)
LTα-Q107E -p55TNF1.41×1054.06×10-42.88
wtLTα-p55TNF7.19×1041.86×10-42.59
LTα-Q107E－p75TNFR- d--
wtLTα－p75TNFR6.56×1051.23×10-40.19
注：a Association kinetic constant; b Dissociation kinetic constant; c Equilibrium dissociation constant; d Unmeasurable. The SPR data were analyzed by BIA evaluation software version 3.0.
表选项
2.2 LTα-Q107E对大鼠MIS及血清AST、CK、LDH活性的影响

与假手术对照组相比，大鼠心脏缺血-再灌注(I/R)模型组的MIS，血清AST、CK及LDH活性均明显增加(P<0.05)。当大鼠在rhLTα处理后，与再灌注模型组比较，rhLTα-Q107E组可明显缩小MIS，降低血清AST、CK及LDH活性(P<0.05)，而野生型rhLTα组的作用不明显(P>0.05)，见表 2。

表 2 p55TNFR选择性淋巴毒素对大鼠梗死面积(MIS)及血清AST、CK、LDH活性的影响 Table 2 Influence of p55TNFR selective rhLTα to the rats MIS and serum AST, CK, LDH activities
(x±s )
组别MIS(%)AST(U/L)CK(U/L)LDH(U/L)
假手术对照组2.05±0.1698.46±9.1082.39±8.8538.80±3.77
缺血-再灌注组28.12±3.77170.90±22.48169.85±22.7271.17±7.48
rhLTα治疗组26.27±2.02159.66±15.91154.73±9.5565.08±6.86
rhLTα-Q107E治疗组15.93±1.95102.83±14.12106.68±9.8446.93±5.89
表选项
2.3 LTα-Q107E对心肌I/R损伤大鼠血清MDA和SOD的影响

与假手术对照组比较，大鼠心脏缺血-再灌注模型组大鼠血清MDA含量增加，而SOD和GSH-Px活性降低(P<0.01)。与再灌注模型组比较，rhLTα-Q107E组可明显降低血清MDA含量(P<0.05)，提高血清SOD和GSH-Px的活性(P<0.05)。而rhLTα组的作用不明显(P>0.05)，见表 3。

表 3 p55TNFR选择性淋巴毒素对大鼠血清MDA和SOD的影响 Table 3 Influence of p55TNFR selective rhLTα to serum MDA and SOD in rats
(x±s )
组别MDA(nmol/mL)SOD(μg/mL)GSH-Px(U/mL)
假手术对照组4.25±0.495.70±0.38850.9±110.8
缺血-再灌注组5.81±0.534.29±0.52607.1±71.1
rhLTα治疗组5.42±0.404.63±0.49617.3±94.4
rhLTα-Q107E治疗组4.36±0.315.35±0.61751.5±101.6
表选项
3 讨论

淋巴毒素α(Lymphotoxin-α，LTα)又称为TNFβ，是TNF家族成员之一。研究发现LTα即可与细胞表面受体p55(TNFR1)相结合，又可与p75(TNFR2)结合。LTα与细胞表面这二种受体结合进而激发相应的信号转导而发挥生物学作用[9, 10]。p55TNFR较均匀地分布于除红细胞外的所有类型的细胞中，p75TNFR受体则仅在免疫细胞等少数种类细胞内高表达[11, 12]。研究表明p55TNFR可介导炎症反应、细胞毒作用、抗病毒、免疫调节、抗辐射等多种生物学作用[8]。而p75TNFR目前已知的主要功能是其膜外部分脱落形成可溶性p75TNFR，通过中和体内过量的TNFα抑制炎症反应[13]。体内和体外实验结果证实p75TNFR具有与p55TNFR竞争LTα的作用，从而使LTα对p75TNFR高表达的细胞(如骨髓来源细胞和心肌细胞)不敏感。此外，LTα通过p55TNFR引起p75TNFR膜外部分脱落形成的可溶性p75TNFR进一步抑制了LTα的功能发挥。研究表明肿瘤坏死因子(TNFα)和淋巴毒素(LTα)具有保护啮齿类动物免于致死剂量核辐射的作用[14, 15]，并认为这种功能是通过上调线粒体中锰过氧化物酶(MnSOD)而减少辐射对线粒体DNA的损伤实现的。TNFα可减少化疗药物引起的中性粒细胞的下降程度、而LTα则表现出减少化疗药物引起血小板、红细胞下降的功能[16]。

在本课题中，笔者首先通过计算机分子模拟技术，对野生型LTα的氨基酸进行定点突变，产生多个突变体，然后检测这些突变体与p55TNFR、p75TNFR存在的相互作用，通过BIAcore进行验证，最终筛选到LTα-Q107E突变体仍具备结合p55TNFR的能力，但与p75TNFR几乎不结合。获得该突变体初步实现了我们拟通过减少野生型LTα对p75TNFR的结合能力，避免后者与p55TNFR竞争LTα的作用。

接下来通过构建大鼠心脏缺血-再灌注(I/R)模型，分别加入野生型rhLTα和rhLTα-Q107E突变体蛋白进行处理，发现rhLTα-Q107E突变体蛋白可以减少心肌梗塞面积(MIS)，而且心肌酶谱检测发现，相应的指标包括AST、CK及LDH的活性均减少，提示rhLTα-Q107E突变体可以减少心脏缺血-再灌注导致的心肌损伤。MDA是氧化应激的主要产物，其水平的高低反映了细胞受自由基攻击和损伤的程度[17]；相反，SOD是细胞内一种抗氧化酶，其水平的高低可以间接反映细胞内抗氧化能力[18]；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)是体内另一种重要的过氧化物分解酶，通过特异地催化还原型谷胱甘肽变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而稳定细胞膜结构，减轻过氧化物对细胞的损伤。笔者还通过检测氧化/抗氧化指标，发现rhLTα-Q107E突变体可以降低MDA的水平，提高SOD和GSH-Px的水平，表明rhLTα-Q107E突变体可以提高心肌细胞的抗氧化能力，并且通过清除细胞内的氧化应激产物MDA等，减少其在氧化应激条件下的心肌细胞损伤。

综上所述，大鼠心脏缺血-再灌注(I/R)模型中的研究数据提示，rhLTα-Q107E突变体可通过逆转心肌缺血-再灌注后MDA的升高及SOD和GSH-Px的下降，直接清除氧自由基、增加内源性抗氧化酶系统的活力而对心肌缺血-再灌注损伤发挥保护作用。因此，利用特异性激活p55TNFR的rhLTα-Q107E突变体将有可能在心肌缺血-再灌注损伤防治中发挥重要的作用。对于rhLTα-Q107E突变体如何发挥心肌保护作用的具体机制尚需进一步的研究。

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