肠黏膜屏障是机体屏障系统的重要组成部分，多种因素如炎症介质、氧化应激、微循环障碍及缺血-再灌注损伤等可导致肠黏膜屏障损害^{[1, 2]}。一旦黏膜屏障被破坏，黏膜下层组织将暴露在肠腔复杂的抗原之中，启动免疫反应，从而产生大量细胞因子，进一步加重肠黏膜损害^[3]。Shimizu等^[4]研究发现休克可导致肠黏膜破坏，引起菌群移位，使肠腔内菌群产生内毒素。

肠巨噬细胞主要分布在肠黏膜下的固有层中，其总数占人体组织中巨噬细胞的绝大部分，对维持肠屏障功能具有重要作用，其活化可以产生大量TNF-α、IL-6等炎症介质，形成级联反应，导致细胞功能障碍，引起肠屏障功能障碍(intestinal barrier dysfunction，IBD)^[5]。髓系细胞触发受体-l(triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM-1)主要在中性粒细胞和单核巨噬细胞上表达，能诱导中性粒细胞和单核细胞分泌TNF-α等促炎因子^{[6, 7, 8]}，而TREM-1刺激巨噬细胞比中性粒细胞能更有效地产生促炎细胞因子。本文拟通过体外细胞实验，探讨TREM-1的表达对大鼠肠巨噬细胞凋亡的影响，进一步明确肠巨噬细胞在IBD中可能作用。

SD健康大鼠，质量200～250 g，由扬州大学实验动物中心提供；RPMI1640培养基、FBS、Penicillin和Streptomycin购自Hyclone公司(USA)；等渗细胞分离液(Percoll solution)、胶原酶IV购自Worthington公司(USA)。台式离心机购自北京百晶生物技术有限公司，倒置显微镜购自Olympus公司(Japan)，荧光显微镜购自Leica公司(Germany)，流式细胞仪购自BD公司(USA)

大鼠以0.3%戊巴比妥钠麻醉，无菌解剖，迅速取全肠。用预冷PBS(pH=7.4)液冲洗肠腔，纵向剖开，置于含1 g/L EDTA的Hanks平衡盐溶液中，37 ℃水浴振荡60 min。弃上清液，用5 g/L胶原酶IV消化2 h，所得细胞悬液400目筛网过滤。再以Hanks液洗涤，重悬于500 g/L等渗细胞分离液，4 ℃2 000 r/min离心15 min，收集细胞沉淀即为肠巨噬细胞，以无钙、镁Hanks液洗涤3遍，用台盼蓝染色，细胞活力约为85%。计数肠巨噬细胞，以RPMI1640培养基(10%FBS，100 U/mL Penicillin；100 U/mL Streptomycin)调细胞浓度至5×l0⁵L^-1接种于6孔培养板和96孔培养板中，每孔分别为2 mL和200 μL，置于37 ℃5% CO₂培养箱中培养。

将肠巨噬细胞接种于24孔板中，让其贴壁生长；待细胞生长状态良好后，移除培养基，PBS清洗2次，每次10 min；加1 mL预冷甲醇固定，37 ℃孵育20 min；用1 mL PBS 清洗3次，每次5 min；用1 mL PBS液在4 ℃下处理细胞10 min；移除PBS液，室温下用PBS清洗细胞5 min；加1 mL PBS液，37 ℃下处理细胞30 min；加一抗(CD14，1∶ 300稀释)，4 ℃下孵育过夜；移除一抗，用PBS清洗5 min；加二抗，37 ℃孵育1 h；用PBS洗涤3次，每次洗5 min；封片，于荧光显微镜下观察并拍照，阳性信号为绿色荧光。

大鼠肠巨噬细胞置于96孔板中培养，每200 μL培养液；设3组，每组6孔。对照组：未加LPS和LP17；LPS组；LPS+ LP17组。加入药物LPS和LP17，给药浓度：LPS(1 mg/L)，LP17(0.1 mg/L)，培养6 h后用TUNEL试剂盒及流式细胞仪对大鼠肠巨噬细胞凋亡进行检测。

把准备好的细胞涂片或爬片自然晾干。把晾干的样本浸入固定液，室温(15～25 ℃)固定15～60 min。按照说明书操作，荧光显微镜下观察，使用的激发波长范围为450～500 nm，发射波长范围为515～565 nm(绿色荧光)。

将各组的巨噬细胞经细胞刮棒刮下后，收集至离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液；2 mL PBS洗涤1次；离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4 ℃，1～2 h；离心弃去固定液，3 mL PBS重悬5 min；400目的筛网过滤1次，1 000 r/min离心5 min，弃去PBS；用1 mL PI染液(100 U/mL)染色，4 ℃避光30 min；流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488 nm，发射光波波长大于630 nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图。

利用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

细胞生长状态良好，分布均匀，细胞活力约为80%～85 %，大鼠肠巨噬细胞CD14免疫荧光鉴定证实为肠巨噬细胞。

经药物处理后，TUNEL检测肠巨噬细胞的凋亡情况：LPS组(44.33±7.74)%较对照组(19.17±6.01)%明显增多(P=0.000)，LPS+LP17组(28.33±6.53)%的凋亡细胞比LPS组(44.33±7.74)%明显减少(P=0.004)，对照组(19.17±6.01%)与LPS+LP17组(28.33±6.53)%的凋亡细胞差异无统计学意义(P=0.050)。

经药物处理后，分析细胞的凋亡情况：LPS组(16.47±1.66)%较对照组(7.70±1.52)%明显增多(P=0.000)，LPS+LP17组(11.47±3.12)%的凋亡细胞比LPS组(16.47±1.66)%明显减少(P=0.018)，对照组(7.70±1.52)%与LPS+LP17组(11.47±3.12)%的凋亡细胞差异无统计学意义(P=0.061)，见图 1。

图 1 流式细胞仪检测大鼠肠巨噬细胞凋亡 Fig 1 Rat intestinal macrophage apoptosis by flow cytometry

图选项

TREM-1是近年来发现的一种细胞表面分子，其在人类中性粒细胞和成熟单核细胞中已经被确认^[9]。TREM-1为免疫球蛋白超家族成员，是主要表达于中性粒细胞和单核细胞表面的单次跨膜受体蛋白，与配体结合后激活TREM-1信号通路，在炎症级联放大反应和脓毒症发生发展中起重要作用^{[10, 11]}。巨噬细胞具有吞噬细菌及内毒素和递呈抗原的作用。炎症发生时，LPS能诱导TREM-1在中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞中的表达，使其激活上调可触发多种炎症相关细胞因子如TNF-α、IL-6，诱导中性粒细胞脱颗粒和单核巨噬细胞吞噬作用，从而放大炎症反应^{[9, 12, 13]}。

LP17多肽能减弱甚至可以阻断TREM-1信号通路的激活，抑制炎症因子过度表达，调节炎症反应^[14]。用LPS刺激小鼠脓毒症模型，给小鼠注射LP17具有保护作用，且其保护作用与LP17呈剂量相关性，说明LP17可能有治疗脓毒症作用^[15]。在重症急性胰腺炎诱导多器官损伤模型中可以检测到TREM-1的显著增高，LP17则可有效降低TREM-1的表达，减轻炎症因子的释放，从而减轻多器官损伤^{[16, 17, 18]}。使用LP17调节TREM-1通路可以减轻脓胸大鼠的胸腔积液和全身性炎症反应^[19]。

本研究通过TREM-1阻滞剂LP17及LPS处理肠巨噬细胞可以减少细胞凋亡，利用LP17阻断TREM-1信号转导可减轻肠黏膜损害，有望成为治疗IBD的新靶点。