2015, Vol. 24
再灌注治疗是影响急性心肌梗死急诊介入和溶栓治疗疗效的重要因素，Zhao等[1]发现的缺血后适应可有效降低心肌梗死面积、减轻细胞凋亡、改善血管内皮功能，在多种属研究中均发现后适应具有保护作用[2, 3, 4, 5, 6]。但在临床应用中，闭塞部位反复机械扩张和堵塞，容易导致冠脉斑块碎裂、远端栓塞乃至冠脉夹层等并发症，存在一定风险。故国内外学者提出了药物后适应的概念，即使用药物模拟机械后适应的细胞保护机制，无需机械刺激却发挥同样的心肌保护作用。
机械后适应的最上游触发因子目前尚未完全明确Penna 等[7]和Cohen等[8]提出的酸中毒和适量氧自由基假说引起了学者关注。既往研究发现在缺血心肌局部注射乳酸可较好模拟心肌酸中毒[9]；另外，近年来多项研究发现氢气可有效清除羟自由基(·OH)和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)，而对超氧负离子(O2-)和双氧水(H2O2)等无抑制作用[10, 11, 12, 13]。造成组织损伤的自由基主要是羟自由基和过氧亚硝基阴离子，而超氧负离子和双氧水可激活多条细胞保护通路。因此本研究拟在活体大鼠急性心肌梗死再灌注模型中，使用乳酸和饱和氢盐水模拟Cohen提出的触发因子，并重点观察上述药物对心肌细胞凋亡以及MAPK 途径的影响，以进一步探讨后适应保护机制的上游触发因子。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 1.1.1 实验分组健康雄性SPF级SD大鼠108 只，购于山东大学实验动物中心，随机(随机数字法)分为6 组。(1)假手术组(Sham)：开胸并分离左冠状动脉，穿线但不结扎，旷置45 min后在心脏前壁注射生理盐水60 μL；(2)缺血-再灌注组(R/I)：缺血45 min后将压力泵压力调至0 atm(1 atm=101.325 Pa)，移除球囊后立即在缺血部位分三点注射生理盐水共计60 μL，而后持续再灌注；(3)后适应组(M-Post)：缺血45 min后、再灌注前通过球囊放气-充盈实现再灌注和缺血反复4 轮，其时间为20/20 s×4，移除球囊后立即在缺血部位分三点注射生理盐水共计60 μL，而后持续再灌注；(4)乳酸组(Lac)：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三点注射乳酸共计60 μL，而后持续再灌注；(5)氢饱和盐水组(Hyd)：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三点注射氢饱和盐水60 μL，而后持续再灌注；(6)乳酸+氢饱和盐水组(Lac+Hyd)：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三点注射乳酸和氢饱和盐水稀释液各60 μL，而后持续再灌注。
1.1.2 模型制备大鼠称质量后腹腔注射麻醉(2%戊巴比妥钠,0.23 mL/100 g)，气管插管成功后呼吸机辅助呼吸(HX-200 型小动物呼吸机，潮气量 30 mL/ kg ,频率50～60 次/min ,吸呼比1∶ 2)开胸显示心脏后，于左心耳下缘与肺动脉圆锥间用5-0无创带针缝合线穿过前降支深部，将后扩张冠脉球囊垫于血管与结扎线之间用力结扎(Grip，3.0×12 mm，Acrostak 公司，瑞士，压力调为1 atm)，而后迅速调整为12 atm。45 min后压力迅速减为0 atm，根据分组给予不同处理。再灌注3 min后以1 mL注射器抽取右心房血液0.5 mL，立即使用血气分析仪测定pH值。术后24 h再次麻醉后经右颈总动脉插入左心室导管，使用生物信号及压力测试系统监测主动脉及左心室血流动力学参数。最后通过颈动脉插管抽取血3~4 mL，处死大鼠取心脏，准备行心肌细胞凋亡检测。另术后30 min每组各取6只大鼠直接处死取左心室缺血心肌组织冷冻后，拟行Western blot检测。
1.1.3 主要试剂乳酸(北京化学试剂公司,中国)为分析纯产品，注射前使用4 mol/L NaOH滴定pH至5.5备用；氢气饱和盐水按文献[14]方法制作,将高压氢气(输出压力0.4 MPa)通人0.9％氯化钠6 h以达到饱和，4 ℃保存,3 d内使用；注射用生理盐水使用4 mol/L NaOH滴定pH至7.4备用。微量丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物岐化酶(superoxide dismutase ，SOD)试剂盒购自南京建成科技有限公司。凋亡检测试剂盒购自Promega公司(美国)。P-ERK、P-p38、P-JNK、TNF-α、Caspase-8多克隆抗体购自Santa Cruz公司(美国)，相应二抗购自Amersham公司(瑞典)。
1.1.4 指标测定血流动力学监测：再灌注后24 h大鼠腹腔注射麻醉后，经右颈总动脉插入左心室导管，使用生物信号及压力测试系统描记颈动脉和左心室压力曲线，以MFL lab 200软件分析心率、平均主动脉压(mean artery pressure,MAP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。
血浆pH值测定：再灌注3 min后，以1 mL注射器抽取右心房血液0.5 mL，立即使用血气分析仪测定pH值，同时无菌棉球填塞止血。
缺血心肌组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定：分别采用硫代巴比妥酸法和分光光度计法测定心肌组织MDA含量和SOD活性，操作严格按照试剂盒说明书进行检测。
心肌细胞凋亡指数的检测：处死大鼠取缺血心肌组织置于中性甲醛固定24 h,常规石蜡包埋,用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记法进行心肌组织切片细胞凋亡的原位检测。每张切片于凋亡细胞分布区域各取5个高倍视野,计算平均每100个细胞中的凋亡细胞数,并以百分数(%)表示心肌细胞凋亡指数。
Western blot检测：缺血心肌组织匀浆后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，而后经转膜、2次免疫反应，抗原抗体复合物用ECL法显示，采用Image-Pro Plus 图像分析软件(Version 4.1,Media Cybernetics,LP,美国)分析蛋白条带的积分吸光度值(IOD值)，吸光度值=平均吸光度值×面积。另以兔抗大鼠β-actin (1∶ 200)单克隆抗体同上操作作为对照，以靶蛋白IOD值/β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相对表达水平。
1.2 统计学方法应用 SPSS 13.0 统计软件，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 血流动力学如表 1所示，心率和平均动脉压各组大鼠差异无统计学意义。+dp/dtmax和-dp/dtmax在Lac、Hyd和Lac+Hyd组均显著高于I/R组(P＜0.05)；Lac+Hyd组与M-Post组间比较差异则无统计学意义(P＞0.05)，Lac组和Hyd组则均显著低于M-Post组(P＜0.05)。
2.2 右心房血浆pH值比较如表 1所示，Lac和Lac+Hyd组pH值较R/I组明显降低(P＜0.05)，同M-Post组相似。Hyd组低于R/I组但差异无统计学意义(P>0.05)，且明显高于M-Post组(P＜0.05)。
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组别 | 心率 (次/min) (n=6) | MAP (mmHg) (n=6) | +dp/dtmax (mmHg/s) (n=6) | -dp/dtmax (mmHg/s) (n=6) |
pH (n=18) | MDA (nmol/mgpro) (n=6) | SOD (U/mgpro) (n=6) |
| 假手术组 | 391.32±31.25 | 101.63±9.27 | 966.12±60.62ab | 721.82±86.16ab | 7.45±0.01b | 0.82±0.16ab | 74.68±4.69ab |
| I/R组 | 355.61±20.16 | 99.36±11.21 | 606.27±63.62b | 436.01±37.76b | 7.43±0.03b | 1.56±0.21b | 35.48±12.46b |
| M-Post组 | 364.26±35.27 | 104.32±5.24 | 786.61±56.73a | 549.62±57.76a | 7.33±0.04a | 1.13±0.36a | 59.52±12.17a |
| Lac组 | 354.37±31.72 | 99.28±5.42 | 688.62±61.02ab | 486.18±34.4ab | 7.32±0.05a | 1.52±0.26b | 46.99±18.02b |
| Hyd组 | 363.27±36.61 | 99.88±9.27 | 693.67±43.26ab | 468.19±36.88ab | 7.38±0.06b | 1.14±0.19a | 58.38±13.72a |
| Lac+Hyd组 | 374.18±31.92 | 102.01±6.72 | 779.16±68.71a | 539.27±56.21a | 7.32±0.06a | 1.14±0.16a | 57.92±15.12a |
注：MAP 平均动脉压，+dp/dtmax 左心室内压最大上升速率，-dp/dtmax 左心室内压最大下降速率；与I/R组比较，aP<0.05；与M-Post组比较，bP<0.05；1 mmHg=0.133 kPa
如表 1所示，与R/I组比较，Hyd和Lac+Hyd组丙二醛显著降低，SOD显著升高(P＜0.05)，以上两者含量同M-Post组相似(P＞0.05)。Lac组与R/I组差异无统计学意义(P＞0.05)，MDA明显高于M-Post组(P＜0.05)，SOD明显低于后适应组(P＜0.05)。
2.4 心肌细胞凋亡比较如图 1所示，假手术组很少见到TUNEL染色阳性的心肌凋亡细胞，Hyd和Lac+Hyd组细胞凋亡指数显著低于R/I组(10.67±4.16)%,(9.50±1.51)% vs.(15.21±1.91)%,P＜0.05;且与M-Post组相似(10.67±4.16)%,(9.50±1.51)% vs.(9.23±2.03)%,P＞0.05；Lac组细胞凋亡指数低于R/I组但差异无统计学意义(13.97±2.47)% vs.(15.21±1.91)%,P>0.05，且显著高于M-Post组(13.97±2.47)% vs.(9.23±2.03)%,P＜0.05。
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| 与R/I 组比较，a P<0.05；与M-Post组比较，b P<0.05 图 1 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较 Fig 1 Comparison of apoptotic index |
如图 2所示，P-p38表达(1.62±0.15)，(0.58±0.21)，(0.46±0.06)vs.(2.18±0.32),P<0.05,和P-JNK表达(1.22±0.13)，(0.66±0.20)，(0.59±0.03)vs.(1.62±0.29),P<0.05,Lac、Hyd和Lac+Hyd组均明显低于R/I组；与M-Post组比较，Lac和Hyd组P-p38和P-JNK表达明显升高(P＜0.05)，Lac+Hyd组与M-Post组差异无统计学意义 。P-ERK表达Lac和M-Post显著高于R/I组，(1.21±0.13)，(1.96±0.39)vs.(0.57±0.05),P＜0.05；Hyd组显著低于R/I组，(0.30±0.09)vs.(0.57±0.05),P＜0.05；Lac+Hyd组与R/I组相似，(0.55±0.13)vs.(0.57±0.05),P＞0.05；Lac、Hyd和Lac+Hyd组P-ERK表达均显著低于M-Post组，(1.21±0.13)，(0.30±0.09)，(0.55±0.13)vs.(1.96±0.39),P＜0.05。
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| 与R/I 组比较，a P<0.05；与M-Post组比较，b P<0.05 图 2 Western blot检测P-p38、P-JNK和P-ERK表达 Fig 2 Comparison of the expression of P-ERK，P-JNK and P-p38 MAPK by Western Blot |
如图 3所示，与R/I组比较，Lac、Hyd和Lac+Hyd组TNF-α表达 和Caspase-8表达 明显降低； Lac和Hyd组表达明显高于M-Post组(P＜0.05)，Lac+Hyd组与M-Post组比较差异无统计学意义 。
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| 与R/I 组比较，a P<0.05；与M-Post组比较，b P<0.05 图 3 Western blot检测TNF-α和Caspase-8表达 Fig 3 Comparison of the expression of TNF-α and Caspase-8 by Western blot |
再灌注损伤时急性心肌梗死溶栓或急诊介入治疗后影响疗效的重要因素，2003年Zhao等[1]提出的缺血后适应为此提出了新思路，而后的多种属研究均发现缺血后适应可有效减轻心肌细胞凋亡、减少心肌梗死面积和再灌注性心律失常，改善心功 能。但机械后适应因需要在病变部位反复扩张球囊，临床应用具有一定风险，所以近年来提出了药物后适应的概念，即使用药物模拟机械后适应的细胞保护途径，又可避免上述机械操作的风险，近年来成为研究的热点。
笔者既往研究发现使用乳酸和低剂量依达拉奉可有效模拟机械后适应的触发因子，即短暂缺血带来的局部组织酸中毒的延长和短暂灌注带来的适量氧自由基生成[9]。众所周知，氧自由基中羟自由基具有极强的细胞损伤作用，是再灌注损伤的重要元凶；而超氧负离子和双氧水细胞损伤作用很小，同时可激活诸多细胞因子，被称为信号氧自由基。依达拉奉并不能选择性清除氧自由基，且如果剂量过小，不能有效抑制羟自由基的损伤作用，如剂量过大会导致信号氧自由基过少影响保护性分子的激活。Ohsawa等[11]和Zhang等[14]发现氢气可选择性清除羟自由基和过氧亚硝基阴离子，而对超氧负离子和双氧水的信号氧自由基无抑制作用。本研究发现Lac组可有效降低再灌注后血浆pH值，Hyd组可有效降低氧自由基含量，降低MDA同时升高SOD，同M-Post组相比差异无统计学意义。所以理论上Lac+Hyd组可以更好发挥二者的协同作用，更好模拟机械后适应的最上游触发因子。
既往研究发现缺血后适应可通过MAPK途径发挥保护作用,后适应可增强ERK磷酸化,抑制p38和JNK的磷酸化[15, 16, 17, 18],继而通过抑制TNF-α进一步抑制NF-κB等，从而抑制凋亡信号瀑布的激活[19]。本研究发现Lac+Hyd组P-p38/JNK浓度显著低于R/I组，同M-Post组相似，上述结果进一步验证了乳酸和氢盐水组合模拟机械后适应的细胞保护机制。但Lac+Hyd组P-ERK较M-Post组显著降低，同R/I组相似；同时Hyd组P-ERK显著低于R/I组，以上结果同Cardinal等[20]关于氢气对ERK磷酸化的影响相一致。虽P-ERK的激活上同机械后适应不同，但在下游TNF-α、Caspase-8表达方面，Lac+Hyd组同M-Post组相似，最终凋亡指数也同M-Post组相似。上述结果再次说明缺血后适应和氢盐水减轻细胞凋亡机制的复杂性。
本研究的不足之处是未能测定缺血心肌组织的pH值，而是使用右心房血浆pH值作为替代指标；另外，未能直接测量羟自由基、超氧阴离子和双氧水的浓度，未能直接判断其对下游信号分子的影响，这也是本研究的不足之处。
综上所述，本研究发现乳酸和饱和氢盐水联合使用可较好模拟机械后适应的上游触发因子，有效减轻心肌细胞凋亡；但会抑制ERK的磷酸化，故具体保护机制还需要进一步探讨。
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