心脏骤停事件是我国发生率与病死率均高的重大卫生问题，其每年发生高达105万人，出院存活率却低至1.15%^[1]。研究表明，在心脏骤停复苏成功后，将有44%患者继发心功能障碍，后者可致机体循环衰竭，进而加剧其他脏器损伤、甚至再发心脏骤停，已被认定为患者早期死亡及预后结局恶化的关键诱因^[2]。然而，在复苏后救治阶段，目前尚无特别有效的心肌保护方法。近年研究显示，西维来司钠(sivelestat, SV)作为一种中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，能通过抗炎而减轻心脏在内的多个重要器官的局部缺血再灌注损伤程度^[3-6]，但对心脏骤停复苏所致全身性缺血再灌注后心肌保护的作用少有报道。另外，研究证实β-catenin通路是心血管系统疾病进程中细胞功能调控的重要通路^[7]，然尚不清楚其在复苏后心肌病理损伤中的作用。本研究拟利用猪心脏骤停复苏模型，观察SV对复苏后心功能障碍及心肌损伤的潜在保护效应，以及探讨该作用与β-catenin通路间的关系。

国产健康雄性大白猪25头，体重33~40 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供，动物合格证号为SCXK(沪)2020-0006。实验动物抵达后，按动物中心管理要求进行饲养。实验时，采用随机数字表法将动物分为三组，即假手术(Sham)组(n=6)、心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation, CPR)组(n=10)、CPR+SV组(n=9)。Sham组仅完成动物准备，CPR组和CPR+SV组应用室颤法诱导心脏骤停后心肺复苏的方法建立模型。在模型复苏成功后5 min时，CPR+SV组应用微量输液泵经股静脉泵入SV(上海汇伦医药科技有限公司)10 mg/kg、持续1 h，Sham组和CPR组应用相同方法泵入等量溶剂的生理盐水。

动物经过12 h禁食后，联合应用替来他明/唑拉西泮(法国Virbac公司)5 mg/kg和噻拉嗪1 mg/kg(吉林华牧公司)臀部肌注诱导麻醉，待观察5 min左右后放置于三角手术板上，连接心电监护与脉氧饱和度监测，留置耳缘静脉针注射丙泊酚(西安力邦公司)2 mg/kg静脉麻醉、后以4 mg/(kg·h)持续泵入维持麻醉。应用兽用喉镜辅助气管插管，接呼吸机(法国Air Liquide公司)进行机械通气，参数设置为容控模式、潮气量10 mL/kg、呼吸频率12次/min、氧浓度21%。手术切开右侧股动、静脉，分别置入压力监测导管，用于监测血压、房压、采血和用药。手术切开左侧股动脉与右侧颈内静脉，分别置入PiCCO监护仪动静脉端导管，用于评估心功能指标。所有动静脉导管，间断使用浓度为5 IU/mL的肝素生理盐水冲管。手术切开右侧颈外静脉，置入一根室颤诱导电极，用于诱颤。

待动物准备完成并稳定10 min后，经电极释放1 mA交流电诱导室颤，经确认心电节律呈室颤波、血压下降为直线后判定心脏骤停成功，立即断开呼吸机，无干预观察9 min。然后，根据国际指南标准开始心肺复苏救治，即2名专业人员交替实施胸外按压，并应用质量反馈装置监测保障按压深度5~6 cm、按压频率100~120次/min，此外人工胸外按压与球囊辅助通气比例为30∶2。心肺复苏2 min后，首次静推肾上腺素20 µg/kg，此后每3 min重复用药。心肺复苏6 min后，选择150 J能量、双向波，进行电除颤，随即判断是否恢复室上性自主心电节律、以及平均动脉压能否维持在50 mmHg以上(1 mmHg=0.133 kPa)。若心电节律与血压不能维持，即刻启动心肺复苏2 min后再次电除颤，直至动物恢复自主心律和血压、或重复该流程5次后宣告心肺复苏救治失败。复苏成功的动物，重新开始机械通气，持续麻醉监护观察4 h。然后停止通气，拔除气管插管和各种血管内导管，消毒缝合切口，送回猪圈继续观察20 h。

造模前，测量各组动物的体重、体温、心率、血压、脉氧饱和度等生理指标的基线情况。造模期间与复苏后观察期间，记录各组动物的复苏成功率和24 h存活情况。

于基线与复苏后0.5 h、1 h、2 h、4 h时，应用PiCCO监测仪，定期检测每搏输出量(stroke volume, SV)和全心射血分数(global ejection fraction, GEF)等心功能指标的数值。于基线与复苏后1 h、2 h、4 h、24 h时，经股静脉采集2 mL血标本，离心后深低温冻存血清，择期集中应用ELISA法检测心肌肌钙蛋白(cardiac troponin I, cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes, CKMB)等心肌损伤标志物的血清浓度。

于复苏后24 h时，各组随机选择6头猪实施安乐死，迅速获取左室心尖部的心肌组织标本，将新鲜标本剪成小块后，冻存于深低温冰箱中，择期集中应用Western blot法检测β-catenin通路相关蛋白如β-catenin、Cyclin D1、c-Myc的蛋白表达水平，以及凋亡标志蛋白如活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cleaved caspase-9)、cleaved caspase-3的蛋白表达水平，应用目的蛋白与内参GAPDH灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。另外，取少量心肌组织标本，进行固定、包埋、切片等步骤后制成病理切片，择期集中应用TUNEL法检测棕黄色阳性细胞比例，以5个视野的平均值作为细胞凋亡指数。

应用SPSS 22.0统计软件(美国IBM公司)进行数据统计学分析。首先进行计量资料分布的正态性检验，待确认为正态分布后以均数±标准差(x±s)表示，三组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni事后检验。计数资料以百分率表示，两组间比较采用Fisher精确检验法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

造模前，各组动物的体重、体温、心率、血压、脉氧饱和度等生理指标均为正常范围。另外，各组动物的心功能状态与心肌损伤标志物浓度处于一致的水平，组间比较差异无统计学意义(P > 0.05)。CPR期间，CPR组与CPR+SV组分别复苏成功9头、7头，组间比较差异无统计学意义(P > 0.05)。复苏后24 h时，CPR组与CPR+SV组均存活7头，两组存活情况组间比较差异无统计学意义(P > 0.05)。

与Sham组相比，CPR组与CPR+SV组可见复苏后心功能障碍发生，表现为SV和GEF值显著下降，组间比较差异有统计学意义(均P < 0.05)。然而，与CPR组相比，CPR+SV组复苏后心功能状态明显好转，其中SV值在复苏后4 h时、GEF值在复苏1 h后均显著上升，组间比较差异有统计学意义(均P < 0.05)。见表 1。

与Sham组相比，CPR组与CPR+SV组可见复苏后心肌损伤发生，表现为cTnI和CKMB的血清浓度显著上升，组间比较差异均有统计学意义(均P < 0.05)。然而，与CPR组相比，CPR+SV组复苏后心肌损伤明显较轻，其中cTnI和CKMB血清浓度在复苏后4 h和24 h时均显著下降，组间比较差异有统计学意义(均P < 0.05)。见表 2。

与Sham组相比，CPR组与CPR+SV组复苏后24 h时心肌组织中β-catenin通路发生改变，表现为β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达水平明显增加，组间比较差异均有统计学意义(均P < 0.05)。然而，与CPR组相比，CPR+SV组复苏后24 h时心肌组织中β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达水平明显减少，组间比较差异有统计学意义(均P < 0.05)。见图 1。

注：Sham为假手术；CPR为心肺复苏；SV为西维来司钠；与Sham组比较，aP < 0.05；与CPR组比较，bP < 0.05 图 1 各组复苏后心肌组织β-catenin通路的表达变化 Fig 1 The changes of β-catenin pathway in myocardial tissues after resuscitation in each group

图选项

与Sham组相比，CPR组与CPR+SV组复苏后24 h时心肌组织细胞凋亡发生，表现为凋亡标志蛋白cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显增加、同时细胞凋亡指数显著上升，组间比较差异均有统计学意义(均P < 0.05)。然而，与CPR组相比，CPR+SV组复苏后24 h时心肌组织中cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显减少、同时细胞凋亡指数显著下降，组间比较差异有统计学意义(均P < 0.05)。见图 2、3。

注：Sham为假手术；CPR为心肺复苏；SV为西维来司钠；与Sham组比较，aP < 0.05；与CPR组比较，bP < 0.05 图 2 各组复苏后心肌组织凋亡标志蛋白的表达变化 Fig 2 The changes of apoptosis-related proteins in myocardial tissues after resuscitation in each group

图选项

注：Sham为假手术；CPR为心肺复苏；SV为西维来司钠；与Sham组比较，aP < 0.05；与CPR组比较，bP < 0.05 图 3 各组复苏后心肌组织细胞凋亡程度的分析 Fig 3 The analysis of cell apoptosis in myocardial tissues after resuscitation in each group

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SV是一种特异度的中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，主要通过抑制中性粒细胞弹性蛋白酶介导的炎症反应而减轻靶器官损伤，已被发现能通过抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种途径发挥器官保护作用^[8]。临床上，SV主要用于改善全身性炎症反应综合征的急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征，尚无明确的使用禁忌，重点为成分过敏者禁用。研究方面，在缺血再灌注损伤领域，SV同样展示出减轻局部缺血再灌注后多种器官损伤的积极治疗作用。Wang等^[3]利用大鼠建立肢体缺血再灌注损伤模型，研究发现15 mg/kg中等剂量SV能够有效地促进受损肢体组织中的中性粒细胞胞外诱捕网清除，从而实现增强局部血管新生、增加肢体血流灌注、抑制骨骼肌纤维化及改善肢体活动能力等保护作用。Hu等^[4]建立小鼠肝缺血再灌注损伤模型与入选肝切除手术患者，研究发现SV能通过抑制Ninj1/Dusp1轴激活而阻断炎症反应途径、进而减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤程度，以及能促进患者肝切除后肝功能的快速恢复。Ikegame等^[5]在小鼠局灶性脑缺血模型中，研究发现SV能够减轻脑水肿和毛细血管渗漏程度，进而改善脑缺血后神经功能状态，其保护机制与促进血管生成素-1表达和内皮细胞存活后维护脑血管屏障功能有关。Aune等^[6]利用离体大鼠心脏建立缺血再灌注损伤模型，研究发现SV显著降低心肌梗死面积及改善左室收缩功能状态，其保护机制与减少活性氧物质产生及保留一氧化氮有关。在全身性缺血再灌注事件中，仅有一篇研究报道SV能通过抑制NF-κB介导的炎症反应途径而减轻失血性休克所致肺损伤程度^[9]，但尚无SV对心脏骤停复苏后各器官功能障碍的治疗研究。

研究表明，心脏骤停复苏导致机体经历全身性缺血再灌注后，同样将启动炎症反应、氧化应激、钙超载等多种经典病理损伤途径，进而导致心肌细胞功能紊乱、甚至死亡，促使心功能障碍及心肌损伤发生^[10-12]。当前，考虑到局部与系统性心肌缺血再灌注损伤具有类通的病理生理机制，本研究选择探讨SV对复苏后受损心肌的潜在保护效应。参照相关文献资料^{[3-6, 13]}，研究设置在复苏成功后5 min时经静脉泵入SV 10 mg/kg。结果显示，CPR组和CPR+SV组较Sham组动物的心功能指标SV与GEF值显著下降、同时心肌损伤标志物cTnI与CKMB血清浓度显著上升，提示复苏后心功能障碍及心肌损伤发生；然而，在应用SV治疗干预后，CPR+SV组较CPR组动物的心功能指标数值整体上升、同时心肌损伤标志物的整体浓度下降，且在部分时间点的组间比较差异有统计学意义，因而提示SV具有减轻复苏后心功能障碍及心肌损伤程度的保护作用。

研究显示，β-catenin通路在细胞生长、分化、凋亡等多方面均有重要作用，其活化后将通过激活下游效应分子Cyclin D1与c-Myc表达而调控细胞功能^[14]。研究发现，在炎症、高糖、缺血再灌注等多种损伤因素的刺激下，心肌组织中β-catenin通路能过度激活并促进心肌细胞凋亡发生，应用药物抑制β-catenin通路后将减轻细胞凋亡而发挥心肌保护作用^[15-18]。其中，在心肌缺血再灌注损伤事件中，Li等^[18]利用小鼠模型研究发现非编码RNA circARAP1能激活β-catenin通路后促进心肌组织纤维化与细胞凋亡的病理进程。另外，He等^[19]利用小鼠模型研究还发现β-catenin敲除或传统中药活心丸在抑制β-catenin通路后将削弱NF-κB炎症反应途径，从而通过抗炎而改善缺血再灌注所致心功能障碍。基于上述文献资料，本研究选择β-catenin通路探讨SV产生复苏后心肌保护的潜在作用机制。研究设置在复苏成功后24 h时，将动物实施安乐死并获取心肌组织标本进行β-catenin通路与凋亡途径的检测评估。结果显示，与Sham相比，CPR组和CPR+SV组动物心肌组织中β-catenin通路相关蛋白β-catenin、Cyclin D1和c-Myc的表达明显增加，同时凋亡标志蛋白cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达明显增加、伴有细胞凋亡指数显著上升，提示复苏后受损心肌组织中β-catenin通路激活与细胞凋亡发生。然而，在应用SV治疗干预后，CPR+SV组较CPR组动物的β-catenin通路相关蛋白表达明显减少，同时凋亡标志蛋白表达明显减少及细胞凋亡指数显著下降，因而提示SV能够抑制β-catenin通路激活与细胞凋亡过程，其可能成为SV产生复苏后心肌保护的作用途径之一。

综上所述，SV能减轻猪心脏骤停复苏后的心功能障碍及心肌损伤程度，相关保护机制可能与其抑制β-catenin通路激活而减轻心肌细胞的凋亡程度有关。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  朱伟东：研究设计、实验操作、论文撰写与修改；张俊、陈卫挺、徐杰丰：实验操作；张俊：数据收集及整理、统计学分析