2024, Vol. 33
2. 济南市神经肿瘤分子生物学重点实验室，济南 271199;
3. 山东第一医科大学附属人民医院（济南市人民医院）血液净化中心，济南 271199
2. Jinan Key Laboratory neuro-oncology molecular biology, Jinan 271199, China;
3. Department of Blood Purification Center, Jinan People's Hospital Affiliated to Shandong First Medical University (Jinan City People's Hospital), Jinan 271199, China
脑出血是一种常见的急危重症中风亚型，占脑卒中发病的20%左右，具有高致死率、致残率特点[1]，存活者往往存留不同程度神经功能障碍，需要巨大医疗、心理、护理、生物、社会资源综合救治，总体预后不佳。脑出血后常有神经细胞凋亡、自噬性死亡参与，与其他致伤因素相互作用，比如自噬过度激活又可介导炎症反应。目前认为脑出血后炎症反应损害是脑出血后继发性损害的重要因素之一[2]，其可引起一系列级联反应，加重脑出血损害，其中前列腺素合成限速酶环氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）是脑出血后重要炎性反应因子[3]，如何敲低COX-2表达，减轻继发性损害是目前研究热点之一。脑出血后微循环障碍，导致脑组织缺血缺氧，可以加重神经细胞损害，高压氧治疗（hyperbaric oxygen therapy, HBOT）可以改善脑细胞缺氧，在脑出血治疗中发挥的作用越来越突出[4]，但是其分子机制研究尚需进一步研究明确。本研究拟通过RNA干扰技术沉默COX-2基因表达联合HBOT，观察其对脑出血大鼠神经功能、程序性死亡形式的影响，并探讨其机制。
1 材料与方法 1.1 实验试剂与仪器本实验使用试剂包括RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、Evans蓝（美国，Sigma公司），兔抗人HIF-1α、AQP-4、MMP-2/9、Beclin-1、Caspase-3、Bcl-2多克隆抗体（美国，Sigma公司），大鼠AnnexinV-FITC/PI流式检测试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒、Lipofectamine 2000（美国，Bio-rad公司）；仪器包括动物用型号NG90ⅢB高压氧舱（宁波高压氧总厂，中国），大鼠立体定向仪（型号：51600U，上海玉研，中国）。siRNA质粒、引物由北京睿博兴科生物技术有限公司构建，根据NCBI基因数据库检索大鼠COX-2的mRNA基因全长，用基因设计软件设计COX-2的siRNA基因干扰序列：5’-AACTGCTCAACACCGGAAT-3’（Genebank accession NM000963）。
1.2 实验大鼠体重为（280±30）g的SPF级成年雄性SD大鼠96只，实验动物质量许可证号：SCXY（京）2014-0013（由中国医学科学院血液病学研究所实验动物中心提供），动物饲养中心标准饲养条件下饲养。本研究获得济南市人民医院伦理委员会批准（批准号：YYLX2016002）。
1.3 实验大鼠模型建立及分组实验大鼠采用10%水合氯醛按3.5 mL/kg体重腹腔注射麻醉，于立体定向仪上俯卧位固定，常规消毒，切开皮肤各层，矢状线右侧旁开2 mm，前囟后1 mm处，用磨钻磨开直径为1 mm的圆形骨窗，微量注射针头与骨孔垂直进针约6 mm，匀速注射0.5 U凝血酶Ⅶ 5 min，留针10 min，缓慢出针5 min，骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤。
脑出血大鼠模型建立后采用随机数字法分为4组：对照组、高压氧（hyperbaric oxygen, HBO）组、COX-2 RNAi组及联合组，每组24只。COX-2 RNAi治疗组：将载有COX-2 siRNA的质粒1 µg与Lipofectamine 2000 100 µL混合后静置20 min，取混合物10 µL鼠尾静脉注射，造模术后第2天开始给予治疗，隔天1次，到第7天，共3次。HBOT具体方法：HBOT组及联合治疗组大鼠于造模术后6 h内进入氧舱，共7 d，实验大鼠进氧舱后，先纯氧洗舱10 min，纯氧加压15 min，使压力匀速升至0.2 MPa，稳压60 min，20 min以5 kPa/min匀速减压达常压，联合组HBOT完成后，HBO组尾静脉注射100 µL生理盐水，联合组注射COX-2 siRNA干预治疗，隔天1次。对照组及COX-2 RNAi组亦置于氧舱内，模拟相同环境条件，只加压不供氧，对照组、HBO组不给予siRNA治疗。
各组大鼠于治疗后第1、7、14天按发射缺失及反常运动、感觉测试、平衡试验、提尾反射、行走试验项目进行神经功能缺损评分（modified neurological severity score, mNSS评分）[5-6]，该评分为0~18分，分为轻度（1~6分）、中度（7~12分）、重度（8~13分）三个损害层级。
1.4 脑出血脑组织含水量测定造模术后第7天，随机取分组处理后实验大鼠4只/组，遵循动物实验伦理学要求，快速拉颈断头取脑，用于脑出血脑组织含水量测定，步骤参照文献[7]：将脑组织去除嗅球，低位脑干称其湿重（标记为W）后，于100℃烤箱中烘烤24 h至恒重后称取干重（标记为D）。使用公式[脑组织含水量（%）=脑组织（W-D）/W×100%]计算出脑组织含水量。实验重复3次取平均值，用于统计学分析。
1.5 血脑屏障通透性测定各组实验大鼠造模术后第7天，大鼠处死前2 h尾静脉注射2%伊文思蓝（Evans Blue, EB）溶液（2 mL/kg），1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉成功后，心内灌注肝素生理盐水（20 U/mL）300 mL，快速断头取脑出血侧脑组织称重，将脑组织置于二甲基甲酰胺（1 mL/100 g脑组织）60℃孵育24 h，3000 r/min离心15 min，取上清液1 mL，用分光光度计检测波长620 nm吸光度，采用数据软件Oringen 7.0绘制曲线，求得EB含量（μg/g）。实验重复3次取平均值进行统计学分析。
1.6 Annexin V法及TUNEL法检测实验大鼠脑细胞凋亡取各组实验大鼠术后第7天脑组织，制备6 μm脑出血组织切片备用，实验步骤参照TUNEL原位末端标记试剂盒步骤进行检测脑细胞原位凋亡，最后行DAB显色、苏木精复染后，由至少2名经验丰富病理学专家随机取显微镜下3个视野凋亡细胞数取平均值计算凋亡细胞阳性率，参照文献[6]。取脑血肿周围3 mm内脑组织采用流式细胞仪检测细胞凋亡率：脑组织称重，剪碎后，PBS反复冲洗，按0.8 mL胰酶液（0.25%）/100 mg脑组织比例加入胰酶液，37℃，消化20 min，加1 mL PBS，充分过滤后，于4℃离心机，1 000 g，离心5 min，获单细胞悬液，脑细胞流式细胞仪检测凋亡率步骤遵照AnnexinV-FITC/PI试剂盒说明操作[8]。实验重复3次取平均值。
1.7 RT-PCR法检测脑出血周围脑组织COX-2 mRNA表达脑组织总RNA按Trizol试剂盒说明提取，NanoDrop ND-1000行RNA浓度测定，1%琼脂糖电泳检测RNA有无降解，如无降解，合成cDNA后行PCR扩增，引物序列及PCR产物见表 1。RT-PCR反应条件为95℃预变性10 s，95℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，34个循环结束后，继续72℃延伸10 min，终止反应，4℃保存。产物于1%琼脂糖凝胶中电泳后，紫外观察分析仪分析结果。各组COX-2 mRNA表达水平相对表达量计算公式：COX-2相对表达量=灰度值(目的条带)/灰度值（内参），实验重复3次，取平均值用于统计学分析。
| 基因 | 引物序列 | 产物 |
| COX-2 siRNA | 正向引物5’-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3’ | 305 bp |
| 反向引物5’- AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3’ | ||
| GAPDH | 正向引物5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’ | 598 bp |
| 反向引物5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’ | ||
| 注：COX-2为诱导型环氧化酶；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，内参 | ||
实验大鼠造模术后第7天，快速拉颈处死动物，取出各组实验大鼠脑组织，加入RIPA蛋白裂解液（0.1 mol/L NaCl, 0.01 mol/L Tris-CL pH 7.6, 0.01 mol/L EDTA pH 8.0, 1 μg/mL Aprotinin, 100 μg/mL PMSF, 1% NP40）置冰浴60 min，裂解液1 mL，4℃，12 000 r/min离心15 min，提取总蛋白，分装备用。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，在含5%脱脂奶粉TBST封闭液（10 mmol/L Tris，pH 8.0, 150 mmol/L NaCl，0.05% Tween20）中封闭1 h，与每个一抗（1∶500）4℃孵育过夜，用TBST洗涤后，用辣根过氧化物酶结合的二抗（1∶500）在室温下孵育1 h，用增强型化学发光法检测蛋白质[9]。用Image J软件对各组蛋白表达行定量分析。所有实验重复3次，取平均值用于统计学分析。结果判定：目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/同一样本内参的灰度值。
1.9 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。计量资料检测服从正态分布，以均数±标准差（x±s）表示，多组样本均数比较采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 脑出血大鼠模型及COX-2质粒构建结果所有实验大鼠尾状核头部注射凝血酶Ⅶ后脑出血造模成功，无大鼠死亡[7]。Cox-2质粒转染鉴定转染成功后，进行实验。
2.2 神经功能评分影响脑出血造模后mNSS评分第1天，各组大鼠mNSS评分差异无统计学意义（P= 0.852），第7、14天mNSS评分，3个治疗组均低于对照组（均P < 0.01），3个治疗组中以COX-2 RNAi联合HBO组评分最低（P < 0.01）。见表 2。
| 组别 | 实验大鼠造模术后时间点（d） | ||
| 1 | 7 | 14 | |
| 对照组 | 11.39±0.61 | 15.11±1.02 | 11.23±1.11 |
| HBO组 | 10.24±0.52 | 11.11±1.02a | 8.16±0.65a |
| COX-2 RNAi组 | 10.53±0.41 | 11.30±1.33a | 7.21±0.15ab |
| 联合组 | 11.11±0.48 | 8.61±1.32abc | 4.44±0.23abc |
| F值 | 33.601 | 16.003 | 72.522 |
| P值 | 0.852 | < 0.001 | < 0.001 |
| 注：与对照组比较，a P < 0.01；与HBO组比较，b P < 0.01；与COX-2 RNAi组比较，c P < 0.01 | |||
实验大鼠脑出血后血脑屏障通透性早期即开始开放，同时脑组织含水量增加。各组实验大鼠治疗后第7天，各治疗组大鼠脑组织含水量（图 1A）及血脑屏障通透性（图 1B）结果显示，HBO组、COX-2 RNAi组、联合治疗组与对照组比较，均能有效保护血脑屏障，减轻脑组织水肿（均P < 0.05）。COX-2 RNAi组优于HBO组（P < 0.05），而均以联合组治疗效果最明显（P < 0.01）。
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| A：大鼠脑组织含水量（%）；B：大鼠脑组织Evans蓝含量（μg/g）; 与对照组比较，a P < 0.01；与HBO组比较，b P < 0.01；与COX-2 RNAi组比较，c P < 0.01 图 1 各组脑出血大鼠脑组织含水量及血脑屏障通透性比较 Fig 1 Comparison of brain water content and blood-brain barrier permeability in rats with intracerebral hemorrhage in each group |
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采用TUNEL法及AnnexinV-FITC/PI流式法检测脑出血大鼠分组治疗后第7天神经细胞细胞凋亡情况：TUNEL法检测结果发现各治疗组脑血肿周围神经细胞凋亡率[HBO组（11.53±1.01）%，COX-2 RNAi组（9.17±0.78）%，联合组（3.81±1.17）%]较对照组[（23.11±1.15）%]均有不同程度降低，其中以联合治疗组降低最明显（P < 0.01）（图 2A）。AnnexinV-FITC/PI流式法检测结果发现各治疗组[HBO组（10.05±1.01）%，COX-2 RNAi组（7.21±0.53）%，联合组（4.26±0.81）%]与对照组[（13.26±1.11）%]比较，均能有效抑制神经细胞凋亡，联合治疗组抑制最为明显（P < 0.01）（图 2B）。
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| A：Tunel法检测脑出血大鼠血肿周围脑组织凋亡细胞（×400）；B：AnnexinV-FITC/PI法检测脑出血大鼠血肿周围脑组织神经细胞凋亡率 图 2 脑出血大鼠血肿周围神经细胞凋亡率比较 Fig 2 Comparison of apoptosis rate of nerve cells around hematoma in rats with intracerebral hemorrhage |
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实验大鼠分组治疗第7天，各组大鼠脑组织COX-2 mRNA表达水平比较显示：各治疗组[HBO组（0.83±0.22），COX-2 RNAi组（0.60±0.20），联合组（0.30±0.12）]较对照组（1.32±0.20）均有不同程度降低（均P < 0.05），COX-2 RNAi组较HBO组下降明显，以联合治疗组下降最明显。见图 3。
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| 与对照组比较，a P < 0.05；与HBO组比较，b P < 0.05；与COX-2 RNAi组比较，c P < 0.05 图 3 各组脑出血实验大鼠脑组织COX-2 mRNA表达水平 Fig 3 Expression of COX-2 mRNA in brain tissue of rats with intracerebral hemorrhage in each group |
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各实验组与对照组比较，各实验组AQP-4、Caspase-3、MMP-2/9、Beclin-2、COX-2、HIF-1α蛋白表达减少，而Bcl-2表达增加，以联合治疗组最为明显（P < 0.01），联合治疗组、RNAi治疗组减低AQP-4蛋白表达水平明显优于HBO组（P < 0.05）。见图 4。
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| 与对照组比较，a P < 0.05；与HBO组比较，b P < 0.05；与COX-2 RNAi组比较，c P < 0.05 图 4 各组实验大鼠血肿周围脑组织COX-2, AQP-4, Bcl-2, caspase-3, HIF-1α, MMP-2/9，Beclin-1表达情况 Fig 4 Expression of COX-2, AQP-4, Bcl-2, caspase-3, HIF-1 α, MMP-2/9, and Beclin-1 in peri-hematoma brain tissue of experimental rats in each group |
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脑出血是一种高致死、致残性的疾病[10]。随着人口老龄化加剧，脑出血发病率呈上升态势[11]。脑出血后神经细胞的水肿、死亡形式仍然是目前研究的热点。脑出血导致血脑屏障破坏，形成脑积水，同时血肿在吸收过程中产生的毒素导致脑血肿周围炎症反应[12]，如白细胞介素（interleukin, IL）-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子、核因子等，促使血脑屏障进一步开放，加重脑水肿。脑水肿与血脑屏障通透性诸多因素中，AQP-4、MMP-2/9与其关系紧密[13]。另外，COX-2可导致血管扩张和组织水肿，也是开放血脑屏障，导致脑水肿的因素之一[14]。脑血肿及脑水肿引起脑细胞缺血缺氧，进而可造成神经细胞死亡，影响神经功能。
细胞死亡分为凋亡及非凋亡两种形式[15]，而凋亡即程序性死亡，其中Bcl-2，Caspase-3为凋亡重要因素。细胞自吞噬是一种非凋亡形式细胞死亡方式，诸多相关因素中，Beclin-1是自噬的特异性基因，既可调节自噬活性又可参与自噬体形成。
RNAi是一种在细胞内可以抑制特定基因表达的现象，将双链RNA（dsRNA）（500~1 000碱基长度）降解成小片段（21~25个碱基长度），该小片段称为siRNA，siRNA与信使RNA（mRNA）中的同源序列进行互补结合，将会导致mRNA失去功能，导致其不能翻译产生相关蛋白，从而引起目的基因迅速高效沉默[16]。
HBOT已经被证实在缺血性、外伤性、出血性系统疾病中有效[17]。脑出血后血肿周围神经细胞处缺氧状态，导致细胞微环境改变、代谢紊乱等加重损害。HBOT可增加脑组织氧含量，降低氧化负担，改善缺氧微环境，纠正代谢紊乱，减少炎症因子的释放，从而降低血脑屏障通透性，减轻脑水肿，降低颅内压，减少神经细胞死亡，而增加神经细胞、血管再生等。除此之外，高压氧可通过抑制HIF-1α信号通路，抑制COX-2活性以及过氧化物酶活性，并能上调Bcl-2、超氧化物歧化酶等[17]，还可能通过影响血肿周围凝血酶、细胞色素C含量[7]，从而起到保护神经细胞作用。具体机制尚需进一步研究证实。
环氧化酶有多种同工酶，其中COX-2为诱导型，作用机理为促进前列腺素及其他炎性介质生成引起炎症。目前已经有研究将COX-2引入肿瘤治疗以及神经系统疾病治疗领域[18]，COX-2基因沉默已应用于恶性黑色素瘤恶性行为研究之中[19]。以上表明COX-2作用可能不只局限于抑制PG系统。
本研究首次将COX-2 RNAi技术联合HBO进行脑出血后神经功能、脑水肿、血脑屏障通透性、神经细胞凋亡、自吞噬性死亡方面进行研究。结果显示：HBO组、COX-2 RNAi组、联合治疗组均能有效抑制脑出血大鼠血脑屏障通透性并能减轻脑组织水肿，改善脑出血大鼠神经功能，其中，联合治疗组效果最明显。HBOT可通过影响HIF-1α [20]直接调控下游基因MMP-9、VEGF等表达；COX-2可通过HIF-1α、COX-2共同进行相互调节，而AQP-4受细胞色素C、凝血酶、VEGF、Ca2+等多种因素调节[21]。另外，COX-2还可通过炎性介质IL-6、NF-κb [22]等影响血脑屏障通透性及脑水肿形成。本研究揭示COX-2 RNAi技术联合HBO对血脑屏障及脑水肿影响机制与降低了HIF-1α、COX-2、MMP-2/9、AQP-4表达，改善了脑组织缺氧，减少了炎性介质释放有关。
研究证实，脑血肿周围HIF-1α、COX-2表达具有高度一致性，其相互作用可通过共同靶基因VEGF进行，还有可能通过HIF-1α/COX-2信号通路发挥作用[23]。在肝癌研究中发现COX-2抑制剂对HIF-1α转录活性和表达产生抑制作用[24]。高压氧及COX-2 RNAi可下调HIF-1α表达，HIF-1α可影响其下游信号Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BNIP3）活性，BNIP3失活促进Bcl-1/Beclin-1复合体形成，Beclin-1释放减少，从而减少自吞噬死亡。另外，高压氧及COX-2 RNAi均可下调COX-2表达，抑制炎性反应，减少脑组织缺氧，缺氧改善，ATP ase生成增加，促进Ca2+-Mg2+-ATP酶活性增加，促进细胞内Ca2+外流，减少细胞内钙超载。Ca2+水平可影响AQP-4表达，反过来AQP-4也可调节Ca2+水平。在促进神经元的凋亡因素中Caspase-3作用重要，可被Ca2+超载激活。Ca2+外流可抑制Caspase-3表达，抑制凋亡。Ca2+内流减少，可减少自由基的产生，同时影响Bcl-2表达。另外，高压氧、COX-2 RNAi可能还通过影响凝血酶、细胞色素C、VEGF、血氨等调节Bcl-2表达，影响神经细胞凋亡。
本研究通过HBOT与RNAi基因沉默技术结合，能够有效减少血脑屏障通透性，减轻脑水肿，有效抑制细胞凋亡及自吞噬性死亡，高效改善脑出血大鼠神经功能。其机理可能为纠正脑细胞缺氧，减轻炎性反应，抑制神经细胞凋亡、自噬性死亡有关。但由于高压氧、COX-2 RNAi作用的机制复杂，详细机制以及神经细胞死亡方式，本团队拟进一步深入研究，以期为脑出血临床治疗、基础研究提供有利的基础理论及循证医学依据。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 潘强：课题设计、实验操作、论文书写；朱琳：数据收集，统计分析；高勇、朱军、张帅、李强、刁兴涛：实验操作，动物饲养，实验数据收集及整理；宋纯玉：研究设计及论文修改
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