碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌目细菌（carbapenem-resistant enterobacteriales，CRE）是急需研发新抗生素的重要病原菌^[1]，CRE的传播具有速度快、范围广等特点，给临床治疗和感染防控带来了严峻挑战。为了尽可能切断CRE菌株从环境到患者的传播路径，对患者周围环境中CRE菌株的监测和及时消毒显得尤为重要。

烧伤与创面修复科多数患者在换药时创面暴露于环境中，容易发生医院内获得性感染，是本院CRE分离率较高的科室之一。根据《医疗机构环境物表清洁与消毒管理规范》WS/T512-2016要求环境物表检出CRE应增强清洁与消毒频率^[2]，但具体有效的消毒频率在规范中未明确，对消毒后的环境物表CRE持留情况，国内尚未见报道。本研究旨在通过消毒后不同时间节点的CRE检出率，分析含氯消毒剂针对物表定植CRE消毒效果和有效作用时间，探索感染控制的关键，为烧伤与创面修复科病房、重症监护病区、感染科性疾病科等院内高危科室预防和治疗CRE提供参考。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

采样管（浙江拱东医疗器械股份有限公司），NG-Test CARBA5碳青霉烯酶检测试剂盒（长沙中生众捷生物技术有限公司），美罗培南（山东罗欣药业集团股份有限公司），LB肉汤（英国Oxoid公司），中国蓝琼脂粉、消毒剂中和剂（杭州滨和微生物试剂有限公司），含氯消毒剂片剂（杭州西子卫生消毒药械有限公司），基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）及相关试剂（布鲁克，德国）。

1.2 环境物表消毒及样本来源

采用一次性消毒毛巾浸泡于1 000 mg/L含氯消毒剂的溶液中30 min后，取半干不滴水毛巾呈单向“S”形擦拭物表。一床一巾原则，床单元间严格落实手卫生。依据GB 15982-2012《医院消毒卫生标准》^[3]、WST 797-2022《现场消毒评价标准》^[4]，分别在消毒后10 min、30 min、60 min、2 h、4 h和6 h这6个时间节点对该病房的295个物表环境进行采样，6个时间段共采样1 770份。

1.3 环境物表CRE菌株筛查及酶型检测

将采集的样本接种到新鲜配制的5 mL LB肉汤，35℃过夜培养后，取5 μL肉汤接种到含美罗培南0.3μg/mL的中国蓝平板上，35℃孵育过夜。挑取筛选平板上生长单菌落，采用MALDI-TOF MS进行鉴定。将鉴定结果为肠杆菌的菌落进行分纯。分纯后的菌落用NG-Test CARBA5试剂盒进行碳青霉烯酶型检测，具体方法参照厂家说明书。

1.4 伦理学

本研究涉及的样本为环境物表，不涉及任何人源样本，无需伦理学审查。

2 结果 2.1 CRE菌种分布及检出率

经美罗培南筛选平板筛选后，共检出24株CRE菌株，分布在23个样本中。其中“护士站水池、垃圾桶”单一采样点分离出两株CRE，分别为产酸克雷伯菌和阴沟肠杆菌。24株CRE菌种分布如下：3株大肠埃希菌，9株肺炎克雷伯菌，3株产酸克雷伯菌和9株阴沟肠杆菌。总样本的CRE检出率为1.35%（24/1770）。其中，消毒作用30 min后的样本，CRE检出率最低（0/295，0%），随后开始陆续出现CRE菌株；而消毒作用6 h后的样本，CRE检出率最高（14/295，4.7%）（图 1）。

2.2 酶型分布

24株CRE菌株共检出4种酶型，分别是IMP，NDM，KPC和OXA型碳青霉烯酶（图 2），其中KPC型碳青霉烯酶在作用6 h后被检出。除3株分离自消毒作用360 min后的CRE菌株产两种酶型外，其余21株菌为均产单一酶型。另外，消毒作用360 min后，“护士站水池、垃圾桶”采样点分离到的CRE菌株包括三种碳青霉烯酶（KPC+IMP型产酸克雷伯菌和产NDM型阴沟肠杆菌）。这24株CRE分离自17个采样点（图 3）。

3 讨论

碳青霉烯酶是导致肠杆菌目细菌对该类抗生素耐药的最主要机制^[5]。主要包括A类丝氨酸酶(KPC等)、B类金属酶(NDM、IMP和VIM)和D类苯唑西林酶(OXA-48及其变异体)^[6]，大多位于可接合质粒上，能促进碳青霉烯耐药性在不同菌种之间的水平转移^[7]。本研究环境物表中检出了肠杆菌目中常见的碳青霉烯酶KPC，NDM，IMP和OXA，其中大肠埃希菌和阴沟肠杆菌主要以NDM为主，这与笔者以往从临床分离菌种中报道的酶型分布极为一致^[8-9]。既往研究显示，肺炎克雷伯菌中最常见的酶型为KPC^[10]，本研究中占据比例最高的为OXA，这可能与烧伤与创面修复科的患者特点相关，本研究从该科室患者临床样本中分离到多株产OXA型CRE菌株，提示产酶菌株在患者与环境之间存在水平传播。同时，本院烧伤与创面修复科2021年的耐药监测数据显示，CRE中排名最高的是肺炎克雷伯菌，其次是肠杆菌属，本研究中环境分离的菌种排名一致，更进一步说明了物表环境样本与临床患者样本之间的关联性。从纵向时间上的采样点2和15可以看出，IMP型和NDM型碳青霉烯酶，可能存在从产酸克雷伯菌转移到肺炎克雷伯菌和从大肠埃希菌转移到阴沟肠杆菌的现象。此外，本研究中在不同采样点均检出同一种酶型，提示可能存在横向传播的风险。

从采样点分布监测显示，病区内水池台面、床单位周围环境在消毒后2 h、4 h再次检出CRE，在6 h后CRE检出数骤然升高，提示CRE菌株容易在阳性患者、床单元、水池间传播，这与既往文献报道相符^[11-12]。参照目前国家的规范、标准及指南等均未对环境物表检出CRE的消毒频率进行明确规定^[13]，根据本研究结果，科学的消毒间隔时间，能有效减少CRE在病区环境和物表定植，从而减少CRE传播的风险。同时，本研究中其他酶型菌株在≤4 h时均有检出，仅KPC在6 h才被检出，结合以往临床分离菌株中酶型的分布特点，提示在重症监护病区、烧伤与创面修复科病房、感染性疾病科等医院感染高风险科室，应根据检出不同的CRE酶型分布特点来指导、强化清洁消毒的间隔时间。此外，本研究结果显示，采样点1和9在消毒后10 min时，检出CRE菌株，但在30 min、60 min时未检出，这可能是由于10 min时，消毒剂作用效果还未完全显现所致。

综上，本研究得出环境物表的CRE菌株在菌种及酶型分布上均与临床样本存在较大关联，提示CRE菌株存在水平传播的可能。建议对高危科室环境物表的消毒时间间隔缩短至6 h或4 h，以减少耐药菌的环境持留。同时，针对CRE筛查结果阳性患者或环境，医护人员需执行多模式预防与控制策略^[14]，包括手卫生、主动筛查、环境清洁消毒等，这些措施可有效降低重症患者耐药菌的检出率^[15-16]。有学者认为^[17]，手卫生表面与环境、物体表面在本质上属于同一个表面污染链的一部分，近年来手卫生的依从性受到临床医护人员重视并严格监管，然而物体表面及环境清洁消毒的质量管理仍有待于进一步探索。为了有效减少CRE在病区环境与物体表面的定植，减少CRE在病区的交叉传播，高危科室应常规开展环境及高频接触物表CRE主动筛查工作，并根据筛查结果指导多模式管理策略的开展与实施。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  金丁萍、杨晓煊、王朦朦、夏一兰、胡燕燕：样本采集及实验；金丁萍、胡燕燕、韩春茂、陆群：研究设计、论文修改