2023, Vol. 32
2. 南京大学医学院附属鼓楼医院急诊科，南京 210000
2. Department of Emergency, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School, Nanjing 210000, China
肺高压（pulmonary hypertension, PH）是一类复杂的肺血管疾病，以不可逆的肺血管重构和肺循环阻力升高为特征。研究表明，PH的主要病理改变为肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs）的异常增殖和凋亡抵抗[1]，低氧刺激是其重要原因但调控机制尚未完全明确。内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是细胞为应对缺氧等外界刺激的一种特殊反应[2]。IRE1α是介导ERS通路的一种跨膜蛋白，在ERS早期，能够通过剪接产生稳态转录因子XBP1s，促进细胞存活。当持续刺激使ERS无法逆转时，IRE1α可通过与肿瘤坏死相关受体2 (TRAF2)发生反应，促进细胞凋亡[3]。应激活化蛋白激酶（Jun N端激酶，JNK）是哺乳动物细胞中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路的一个分支，能够被IRE1α调控，并在细胞周期、凋亡过程以及应对外界刺激方面发挥重要作用[4]。IRE1α/JNK通路调控细胞增殖或凋亡在多项研究中得到了证实[5]，而在PH中的作用尚不明确。本研究拟构建体外MPASMCs缺氧模型，探究IRE1α/JNK通路是否发挥调控MPASMCs增殖和凋亡的作用。
1 材料与方法 1.1 材料小鼠肺动脉平滑肌细胞系（MPASMCs）购自中国科学院上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素（Gibco公司，美国）；RIPA裂解液（Solarbio公司，中国）；抗β-actin、抗HIF-1α、抗IRE1α、抗P-IRE1α、抗BAX、抗BCL-2、抗PCNA、抗JNK、抗P-JNK抗体（Abcam公司，美国）；HRP标记山羊抗兔二抗、Trizol裂解液（Life Technologies公司，美国）、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ™ Universal SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞公司，中国）；CCK8试剂盒、Annexin V凋亡检测试剂盒（碧云天公司，中国）；脂质体Lipofectamine™ 2000、增强型ECL试剂盒（Invitrogen公司，美国）；XBP-1s过表达质粒及对应阴性对照（吉玛公司，中国）；IRE1a-SiRNA及阴性对照（Santa公司，美国）；SP600125（Sigma公司，美国）。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与处理MPASMCs在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃，5%CO2，达到70%~80%融合后转入三气培养箱进行缺氧培养，调整为37℃，1%O2，5%CO2，在缺氧培养后一定时间取出细胞进行下一步实验。进行转染实验时，将对数生长期的MPASMCs接种至六孔板，待细胞达到70%~80%融合后准备转染，按Lipofectamine™ 2000说明书进行转染操作，转染48 h后收集细胞，Western blot和Real-time qPCR检验转染效率。用SP600125处理细胞时，将SP600125试剂溶解于DMSO，配成1 mmol/L母液，再取适量母液加入细胞培养基中使得抑制剂终浓度为10 μmol/L，处理24 h后收集细胞，Western blot验证抑制效率。
1.2.2 蛋白表达检测采用Western blot检测β-actin、HIF-1α、IRE1α、P-IRE1α、BCL-2、BAX、PCNA、JNK、P-JNK蛋白表达：用细胞刮刀刮下细胞，用离心机以4℃，1 000 r/min条件离心5 min收集细胞；用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白浓度定量；各组取10 μg总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，根据蛋白相对分子质量剪出合适的膜条带，分别与相应的稀释后一抗（1：1000）4℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×2次后加入HRP标记的兔二抗（1∶1000）室温孵育1 h，再次洗膜后加入ECL发光剂于暗室中显影、曝光，采用Gel-Pro软件对蛋白灰度值进行定量分析。
1.2.3 RNA表达检测采用Real-time qPCR检测XBP-1s基因表达：将MPASMCs细胞用Trizol裂解液裂解，用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。采用ChamQ™ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒和Quant Studio 7 pro仪器（Bio-rad，美国）进行扩增以检测XBP-1s和β-actin的mRNA表达。采用阈值荧光比较周期（Ct）法，将XBP-1s相对转录量与β-actin归一化，采用2-ΔΔCt法计算。所用引物序列（5’-3’）：XBP-1s：正向引物：GACAGAGAGTCAAACTAACGTGG，反向引物：GTCCAGCAGGCAAGAAGGT；β-actin：正向引物：CTCTCCCTCACGCCATC，反向引物：ACGCACGATTTCCCTCTC。
1.2.4 细胞增殖水平检测CCK-8实验检测细胞增殖水平：MPASMCs按1×104个/孔接种于96孔板中，正常孵育过夜，然后每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养1 h，用酶标仪检测450 nm处各孔吸光度值。细胞相对活力为实验组与对照组的吸光度比值。
1.2.5 细胞凋亡水平检测采用AnnexinV流式细胞术检测细胞凋亡水平：收集经处理的各组MPASMCs细胞（约1×106个/组），PBS洗涤后加入10 μL PI和5 μL Annexin V试剂，混匀后室温避光孵育15 min，采用FACS流式细胞仪进行检测，用Flow Jo_V10软件分析凋亡细胞的比例。
1.2.6 统计学方法所有数据均采用GraphPad Prism 8软件进行分析，正态分布的数据采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P < 0.05差异有统计学意义。
2 结果 2.1 MPASMCs缺氧模型构建及实验组选择为了验证缺氧培养的MPASMCs细胞模型是否成功，采用Western blot检测缺氧诱导因子HIF-1α蛋白表达。结果显示，常氧组（N组）HIF-1α蛋白相对表达量为：0.40±0.02，缺氧后4、8、16、24 h（H4-H24组）HIF-1α蛋白相对表达量分别为：H4组2.03±0.06、H8组2.97±0.10、H16组2.22±0.04、H24组1.76±0.03，各缺氧组HIF-1α蛋白表达较N组均显著升高（P＜0.05），其中缺氧8 h变化最为显著（图 1），因此以缺氧8 h的MPASMCs（简称H组）作为实验组进行后续实验。
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| 与常氧对照组（N组）相比，HIF-1α在缺氧4 h（H4，P=0.003a）、8 h（H8，P＜0.001b）、16 h（H16，P=0.002a）、24 h（H24，P=0.003a）的相对表达量 图 1 MPASMCs缺氧模型构建及其实验组选择 Fig 1 Construction of hypoxic model and selection of the experiment groups in MPASMCs |
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MPASMCs经缺氧处理后Western blot实验检测ERS关键蛋白GRP78[(2.96±0.02) vs. (2.00±0.05)，P＜0.05]以及磷酸化IRE1α[(2.12±0.07) vs. (1.21±0.02)，P＜0.05]相对表达量明显上调，IRE1α表达差异无统计学意义[(1.37±0.10) vs. (1.49±0.07)，P＞0.05]（图 2A），磷酸化JNK蛋白表达升高[(1.62±0.07) vs. (1.21±0.03)，P＜0.05]，JNK表达差异无统计学意义[(0.37±0.01) vs. (0.49±0.07)，P＞0.05]（图 2B），提示IRE1α介导的ERS过程和JNK通路均在缺氧后被激活。用Si-IRE1α抑制IRE1α表达，Western blot验证Si-IRE1α组IRE1α蛋白相对表达量较对照组明显减低[(0.41±0.02) vs. (0.76±0.02)，P＜0.05]（图 2C），提示转染成功。在Si-IRE1α处理组缺氧后的MPASMCs，GRP78[(0.82±0.01) vs. (1.06±0.02)，P＜0.05]和P-JNK[(0.44±0.04) vs. (0.84±0.05)，P＜0.05]蛋白表达较H组均显著下降（图 2D），提示IRE1α介导的ERS过程和JNK通路在敲除IRE1α的缺氧组被抑制，即IRE1α可能对于JNK通路存在调控作用。
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| A与B与N组相比，H组A ERS关键蛋白GRP78（P=0.012a）、IRE1α（P=0.681 NS）和P-IRE1α（P=0.002a）相对表达水平；B JNK通路关键蛋白JNK（P=0.301 NS）和P-JNK（P=0.010a）相对表达水平；C Si-IRE1α敲除后验证，与空白对照组（Ctrl组）相比，IRE1α在空载体组（Si-NC组，P=0.783 NS）和Si-IRE1α组（P=0.011a）相对表达水平；D与H组相比，H+Si-IRE1α组GRP78（P=0.025a）和P-JNK（P=0.006b）相对表达水平 图 2 IRE1α介导的ERS和JNK通路在缺氧MPASMCs中均被激活，并在敲除IRE1α后受到抑制 Fig 2 IRE1α-mediated ERS and JNK pathways were both activated in hypoxic MPASMCs and inhibited after IRE1α knockdown |
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H组MPASMCs细胞中PCNA表达较N组显著升高[(0.97±0.09) vs. (0.22±0.01)，P＜0.05]，敲低IRE1α表达后PCNA表达明显下降[(0.45±0.03)，与N组相比, P＜0.05]（图 3A）；CCK8实验结果提示H组450 nm处吸光度较常氧组显著升高[(0.61±0.02) vs. (0.31±0.01)，P＜0.05]，而敲低IRE1a表达后再次下调[(0.38±0.02)，与H组相比, P＜0.05，图 3B]，说明缺氧处理促进MPASMCs增殖，而IRE1α的敲低使得增殖能力下降；缺氧组促凋亡蛋白BAX较常氧组下调[(0.22±0.01) vs. (1.14±0.01)，P＜0.05]，抑制凋亡蛋白BCL-2上调[(1.71±0.01) vs. (0.10±0.01)，P＜0.05]，敲低IRE1a表达后，缺氧组BAX蛋白表达较H组上调[(0.56±0.02)，与H组相比, P＜0.05]，而BCL-2下调[(0.94±0.01)，与H组相比, P＜0.05，图 3A]；与此结果一致，流式细胞分型结果提示MPASMCs凋亡水平在缺氧后被抑制[凋亡细胞比例(19.33%±0.25%) vs. (28.82%±0.79%)，P＜0.05]，而IRE1a敲除后凋亡水平再次上调[(26.00%±0.81%)，与缺氧组相比, P＜0.05，图 3C]。总的来说，缺氧使得MPASMCs出现“促增殖抗凋亡”改变，而IRE1α的敲除部分逆转了缺氧引起的上述表型改变。
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| A N组、H组以及H+Si-IRE1α组PCNA(N vs H P＜0.001c；H vs H+Si-IRE1α P=0.009b)、BAX（N vs H P=0.002b；H vs H+Si-IRE1α P=0.002b）以及BCL-2（N vs H P=0.003b；H vs H+Si-IRE1α P=0.001b B CCK8实验显示，N组、H组以及H+Si-IRE1α组450 nm处吸光度水平（N vs H P＜0.001c；H vs H+Si-IRE1α P＜0.001c）；C流式细胞分型显示，N组、H组以及H+Si-IRE1α组细胞凋亡比例（N vs H P=0.01a；H vs H+Si-IRE1α P=0.02a） 图 3 缺氧促进MPASMCs增殖并抑制其凋亡，IRE1α敲除后促增殖抗凋亡作用被减弱 Fig 3 Hypoxia promoted the proliferation and inhibited apoptosis of MPASMCs, and the pro-proliferation and anti-apoptosis effects were attenuated after IRE1α knockdown |
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为了验证JNK通路在缺氧处理MPASMCs中的作用，使用JNK特异性抑制剂SP600125处理MPASMCs，Western blot提示10 μmol/L SP600125处理后P-JNK表达明显下调[(1.67±0.23) vs. (4.52±0.04)，P＜0.05]，说明JNK通路被显著抑制（图 4A），在缺氧处理后，H+SP600125组PCNA表达较H组下调[(0.37±0.01) vs. (0.88±0.01)，P＜0.05]，BAX表达上调[(1.09±0.01) vs. (0.63±0.02)，P＜0.05]，BCL-2表达下调[(0.43±0.02) vs. (2.48±0.03)，P＜0.05]（图 4B），CCK8结果提示H+SP600125组较H组，450 nm处吸光度明显减低[(0.33±0.03 vs. (0.60±0.02)，P＜0.05]，提示细胞增殖能力显著下降（图 4C）；此外，流式细胞分型显示H+SP600125组较H组细胞凋亡比例明显上调[(21.03%±0.57%) vs. (17.05%±0.25%)，P＜0.05，图 4D]。以上结果表明，JNK通路的阻断抑制了MPASMCs增殖并促进其凋亡，即能延缓缺氧引起的MPASMCs异常增殖和凋亡。
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| A SP600125处理前后P-JNK相对表达水平（P=0.004b）；B H组以及H+SP600125组PCNA（P=0.009b）、BAX（P=0.021a）、BCL-2（P＜0.001c）相对表达水平；C CCK8实验显示，H组以及H+SP600125组450 nm处吸光度（P＜0.001c）；D流式细胞分型显示，H组以及H+SP600125组细胞凋亡比例（P=0.021a） 图 4 抑制JNK通路部分逆转了缺氧引起的MPASMCs促增殖抗凋亡效应 Fig 4 Inhibition of JNK pathway partially reversed the pro-proliferation and anti-apoptosis effects of MPASMCs induced by hypoxia |
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为了进一步验证MPASMCs中IRE1α-ERS对于JNK通路的调控作用，在常氧条件下过表达XBP-1s，模拟缺氧引起的ERS激活效应，Real-time qPCR实验显示，过表达后实验组（OE组）XBP-1s基因2-ΔΔCT值较对照组明显上调[(2.69±0.07) vs. (1.04±0.27)，P＜0.05，图 5A]，说明过表达实验成功。Western blot实验发现OE组较对照组MPASMCs细胞，P-JNK蛋白表达上调[(1.15±0.11) vs. (0.48±0.01)，P＜0.05]，PCNA表达上调[(0.94±0.02) vs. (0.55±0.01)，P＜0.05]，BAX下调[(0.21±0.02) vs. (0.86±0.06)，P＜0.05]，BCL-2上调[(1.08±0.03) vs. (0.33±0.05)，P＜0.05]（图 5B），CCK8实验提示OE组较对照组450 nm处吸光度增加[(0.57±0.02) vs. (0.32±0.04)，P＜0.05]（图 5C），流式细胞分型则提示细胞凋亡比例下调[(13.3%±0.74%) vs. (19.3%±1.28%)，P＜0.05]（图 5D）。证明常氧条件下XBP-1s的过表达激活了JNK通路，进而引起“促增殖抗凋亡”这一典型缺氧改变。
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| A XBP-1s过表达质粒转染后，Real-time qPCR验证Ctrl组和过表达组（OE组）XBP-1s基因表达（P=0.021a）；B Ctrl组和OE组P-JNK（P=0.013a）、PCNA（P=0.002b）、BAX（P=0.003b）、BCL-2（P=0.003b）相对表达水平；C CCK8实验显示，Ctrl组和OE组450 nm处吸光度（P=0.013a）；D流式细胞分型显示，Ctrl组和OE组细胞凋亡比例（P=0.007b） 图 5 常氧状态下过表达XBP-1s激活了JNK通路，同时出现了类似缺氧的改变 Fig 5 Overexpression of XBP-1s under normoxia activated the JNK pathway, accompanied by hypoxia-like changes |
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缺氧性肺血管收缩和肺血管重构是缺氧性肺高压的两大病理特点。短暂缺氧引起肺血管可逆性收缩，可保持通气/血流比值，维持氧分压的稳定，而持续慢性缺氧则会导致肺血管持续的收缩和肺血管结构改变。肺血管重构涉及血管全层细胞的增厚，同时伴有胶原过度沉积和周围炎性细胞浸润。其中肺动脉平滑肌细胞是肺血管重构的关键，其异常增殖和凋亡减低在肺血管重构过程中起决定性作用[6]。
本研究发现，内质网应激在肺高压的发生发展中发挥了重要作用。如前所述，PASMCs的异常增殖、凋亡抵抗是PH的中心环节，而IRE1α所介导的ERS过程对于细胞存活或凋亡的作用取决于缺氧刺激的大小和强度[7]。本研究使用缺氧8 h的MPASMCs所构建的细胞模型中，IRE1a介导的ERS被激活，使得MPASMCs增殖增加，凋亡减少。近年来的多项治疗性研究也表明，用特异性ERS抑制剂4-苯基丁酸可显著抑制PASMCs的异常增殖和凋亡抵抗[8-9]；此外，在肺高压进展到晚期，肺小血管成丛状或网状杂乱增生，部分甚至有血管壁坏死、局部血栓形成，这种严重病变称为“丛状病变”。研究表明，慢性炎症参与了PH肺血管丛状病变的加重过程[10-11]。而抑制ERS过程后，大鼠肺和肺动脉外膜中巨噬细胞和T淋巴细胞的聚集明显被抑制，提示ERS的抑制可能减轻了PH过程中的炎症反应，从而在一定程度上延缓丛状病变的发展[12]。目前ERS促进PH发生的内在机制尚未完全阐明。从现有研究结果来看，内在原因可能包括细胞自噬或者肺血管收缩相关信号激活等，如Han等[13]的研究提示ERS能激活细胞自噬过程，而后者是PH发病过程中的重要环节[14]；Yeager等[15]则认为ERS和促炎生物分子的产生归因于内皮素-1信号通路的激活，而ET-1是调节肺血管收缩的关键蛋白，也是目前治疗PAH公认的靶点之一。
JNK蛋白可被上游的MKK4和MKK7激酶磷酸化而激活，继而通过激活其下游靶点AP1转录因子，广泛参与细胞周期、增殖和凋亡等过程[16]，并且JNK轻度、短暂的激活能促进细胞增殖和存活，而随着刺激加重，转而促进细胞凋亡[17]。Guo等[18]的研究表明，JNK通路在肺血管重构中起到了重要作用。本研究通过构建缺氧MPASMCs模型，验证了JNK通路对于MPASMCs增殖和凋亡的影响受到IRE1α介导的ERS过程调控，即IRE1α介导的ERS激活能通过JNK通路促进MPASMCs增殖并抑制其凋亡，进而促进肺血管重构的发生。综上所述，考虑到针对ERS激活对于缺氧MPASMCs的作用，减轻内质网应激有潜力成为治疗肺动脉高压的方向，值得进一步挖掘。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明：史薪炜、钱骏、史阳阳：实验设计、实验操作；钱骏、王玮：数据整理；史薪炜、钱骏：数据分析、统计学检验；史薪炜：论文撰写；孙凯：实验指导、论文审阅及修改
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