脑卒中（stroke）是一类发病率、致死致残率均高的脑血管疾病，全世界每年约1500万人次发生脑卒中，导致约500万人次直接死亡，约500万人次产生永久性残疾^[1]。数据显示，卒中是导致美国人群长期残疾的主要原因，65岁以上中风幸存者超过一半的活动能力下降，治疗脑卒中和并发症的医疗支出约350亿美元/年^[2]；在我国，脑卒中新发病例超过200万例/年，是伤残寿命调整年增加的首要疾病；目前，其救治依然面临院内延迟、病情复杂、救治效果不佳等挑战^[3-4]；进入老龄化社会后，我国因脑卒中增加的老龄人口医疗和生活负担将进一步加剧^[5-7]。因此，在卒中的预防、治疗药物研发、病程转归的病理生理机制研究、康复治疗举措等方面需要更加深入的研究和探索，如此有望能未缓解脑卒中带来各项挑战提供新的防治及康复策略。

1 铜死亡主要特点及机制

铜稳态的维持对于正常的生命活动至关重要；然而，铜离子过载形成的毒性导致细胞死亡的具体机制一直不清楚^[8-9]。最近，Tsvetkov和Todd R. Golub团队新发现了一种由铜引起的新的细胞死亡途径，由于其不同于以往发现的任何一种细胞死亡方式-将其命名为铜死亡；研究发现细胞内铜的累积是细胞致死的前提，主要在线粒体呼吸的三羧酸循环中起作用；并确定了铜诱导细胞死亡的关键基因——铁氧还原蛋白1（Ferredoxin 1，FDX-1），其通过编码一种Elesclomol靶向的蛋白，将二价铜转化为细胞毒性更大一价的铜离子，敲除FDX-1或者脂酰化相关的酶以及谷胱甘肽通过抑制脂酰化和促进寡聚化(Dihydrolipoamide S-acetyltransferase, DLAT)可以缓解铜依赖性细胞死亡^[10]（机制详见图 1）。目前金属离子在药物输送系统的开发运用，引起生物医学、材料等相关领域科学家的广泛关注，在肿瘤、神经退行性变、心脑血管等疾病中展现出广泛的应用前景；Tsvetkov等揭开了铜引起细胞死亡的具体机制，开启了铜介导的细胞死亡在疾病治疗上的新研究方向，铜死亡在脑卒中的作用、机制及应用研究亟待开展。

2 铜与脑卒中 2.1 铜代谢异常与脑卒中

铜稳态对于器官和细胞的正常代谢具有重要作用。铜是许多脑细胞正常代谢关键过程和神经递质形成的关键成分^[11-12]，在慢性神经退行性变和中风等急性脑部疾病中，铜的稳态常处于失衡状态^[13]。已证实在阿尔兹海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等退行性神经疾病中，动脉斑块内夹杂的过量铜能与聚集的蛋白质相互作用，参与细胞氧化应激导致神经细胞的坏死^[14]。门克斯病和枕角综合征(Menkes disease and occipital horn syndrome, Menkes OHS) 是X常染色体易位，Menkes/OHS基因突变，导致铜转运P型(Adenosine triphosphate, ATP) 酶失活^[15]，此外铜的细胞毒性直接作用于威尔逊病的发生发展^[16-17]。铜还可以通过与谷胱甘肽、半胱氨酸、抗坏血酸等物质进行芬顿循环反应（Fenton reaction cycling）形成活性氧^[18-20]，诱导Caspase-8表达上调加速细胞凋亡^[21]。最近的研究发现细胞内的铜离子累积是导致细胞铜死亡的前提^[10]；生理情况下，外源性铜离子通过人铜离子转运体1 (hCTR1)、铜蓝蛋白、二价金属离子转运体(DMT1)等载体运输进入肠黏膜细胞，然后由铜转运蛋白ATP7A等从肠黏膜细胞跨膜转运至门静脉血循环^[22-23]。肝脏是主要摄取细胞外铜离子的组织，铜离子与超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白（CCS）和抗氧化蛋白1（Human antioxidant protein 1, ATOX1）以及细胞色素氧化酶17（COX17）等铜伴侣蛋白结合后被运到细胞内不同细胞器中，维持细胞的正常功能^[25]；铜泵（Cu⁺-ATPase）将胞内过剩的铜离子以依赖ATP的方式排出胞外^[25]。卒中发生后几分钟脑细胞就出现出缺血缺氧，导致ATP产量显著下降，使得铜转运受限^[26]；铜靶向性输送已被证实能预防退行性神经病变及缓解缺血性脑卒中的神经元损伤^[27]。在卒中时，胞内的铜离子摄取及排除稳态会因ATP产生受限而失衡，铜离子在细胞内的累积有可能会导致细胞铜死亡的发生。

铜离子除了对细胞的直接毒性外，还通过显著增加锌离子的浓度，间接导致细胞死亡，降低胞内铜离子和锌离子异常增加的浓度能缓解细胞的死亡^[28-29]。脑卒中后，梗死区局部的锌离子浓度显著增加，丙酮酸通过剂量依赖性的方式显著抑制细胞色素C释放到细胞质中，保护过多铜离子/锌离子对神经元的毒性^[30]；硫氧蛋白-白蛋白融合蛋白(HSA-Trx) 能通过剂量依赖的方式抑制ROS产生，保护由Cu²⁺/Zn²⁺诱导的内质网(ER) 应激反应^[28]；此外，人血清白蛋白(HSA)通过与铜强烈结合，外渗到缺血性脑损伤部位限制金属催化的氧化应激来提供神经保护，可显著改善短暂性和永久性缺血后的脑缺血损伤^[31]。加快胞内过多的铜离子排除到胞外或螯合过多的铜离子是治疗铜累计的一种手段，深入的研究铜离子的转运和致细胞死亡的机制，将有利于挽救因为铜过载导致的细胞死亡。铜死亡机制的阐明，为解决卒中后细胞发生铜离子转运功能障碍时预防细胞铜的毒性作用提供了新的研究方向。

铜离子在细胞内的转运受多种蛋白和通道的影响。FDX1和蛋白质脂酰化是铜离子过载诱导细胞死亡的关键因子，FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子，铜直接结合并诱导脂酰化DLAT的寡聚化^[10]。丁硫胺酸亚砜胺（Buthionine sulfoximine，BSO）能消耗细胞内的铜螯合剂谷胱甘肽（GSH）降低脑缺血后防御机制形成，有研究表明BSO处理后会加重缺血后的皮质梗死和水肿^[32]；此外，BSO能促进细胞的氧化应激产生，诱导细胞凋亡从而抑制皮质神经元细胞的增殖^[33]。这说明铜离子在细胞内的累积确实存在加重脑卒中梗死的表型，但目前尚无直接证据表明铜死亡参与其中。四硫代钼酸铵(ATTM)是一种铜螯合剂的药物，有临床前损伤模型和龋齿类脑卒中模型中研究证实，ATTM处理显著改善神经缺血-再灌注损伤后神经功能和梗死面积，机制上主要与脑抗氧化酶能力增强和促炎细胞因子水平降低有关^[35]，但ATTM对铜的螯合作用显著降低了细胞内的铜离子水平，也可能是通过降低了游离铜离子在细胞内的累积作用，从而促进脑卒中恢复，但这种猜想尚需要被证实。

2.2 铜相关的线粒体呼吸功能障碍与脑卒中

铜死亡依赖于线粒体呼吸调节，只在三羧酸循环（citric and cycle）中发挥作用，并且细胞内铜离子累积是导致细胞的死亡的关键，研究发现更依赖线粒体呼吸的细胞对铜离子的敏感性比进行依赖糖酵解的细胞高近1 000倍^[10]。大脑需要的能量以ATP的形式持续供应，其中葡糖糖是大部分能量ATP来源，缺血性脑卒中后几分钟内就导致脑细胞氧和葡萄糖耗尽，ATP缺乏随后出现脑卒中梗死区^[35]。神经元细胞、少突胶质细胞所需的ATP主要是通过线粒体内葡糖糖氧化磷酸化生成并提供，少部分由糖酵解提供，而星型胶质细胞ATP主要是由糖酵解提供^[26]。脑卒中时，神经元细胞和少突胶质细胞对铜离子的敏感性从理论上来说比星型胶质细胞高，而神经元和少突胶质细胞对脑卒中后的功能恢复具有更为重要的作用。既往研究证实缺血脑卒中时线粒体功能障碍导致ATP形成减少，脑细胞因为缺乏ATP而死亡^[36]，但是这些细胞死亡类型中是否存在铜介导的死亡尚不清楚；但就铜死亡发生“场地”的依赖于线粒体呼吸和三羧酸循环来说，有理由推测铜死亡有可能是导致缺血缺氧神经细胞和少突胶质细胞死亡的主要方式，但目前还缺乏直接的证据。

卒中后发生的缺血-再灌注损伤引起神经元死亡与NOX2激活和氧化应激增加有关。缺血-再灌注损伤导致琥珀酸选择性积累，使再灌注过程中线粒体活性氧（ROS）产生，ROS引发细胞氧化损伤、死亡和异常的免疫应激^[37]；此外，缺血-再灌注损伤通过激活CK2和NADPH氧化酶，导致DNA损伤和释放线粒体凋亡因子，在铜/锌超氧化物歧化酶转基因小鼠中，降解CK2α和CK2α’以及显著降低CK2β对氧化应激的去磷酸，可以降低氧化应激，增加神经元存活^[38]。降低线粒体的氧化应激能增加神经元的存活，但此过程是否有铜稳态失衡的恢复，依然值得探讨；虽然神经元能释放受损伤线粒体并将其转运到星形胶质细胞中进行处理和回收以减轻ROS的产生，但星形胶质细胞也可以通过CD38和环状ADP核糖信号转导反向释放线粒体进入神经元细胞中，导致神经系统损伤恶化^[39]。综上，线粒体导致的氧化应激损伤参与了脑卒中的进展，为铜死亡的发生提供了“场地”(图 2)。因此，减少线粒体的ROS产生、排除受损的线粒体和拒绝接受损伤的线粒体再进入神经元细胞，铲除铜死亡发生的“沃土”，可能是减少神经元的氧化应激损伤和铜死亡的重要举措。但铜死亡在脑卒中后是否发生，以及在何时发生；细胞的铜稳态失衡与线粒体介导的ROS的产生之间是否具有协同作用，以及对脑细胞死亡的具体作用是促进还是挽救，目前都待揭示。

2.3 铜稳态和铜-锌超氧化物歧化酶在脑卒中的作用

铜-锌超氧化物歧化酶（Cu, Zn-Superoxide Dismutase，SOD1）是细胞对抗ROS有害影响的关键双金属酶，存在于细胞质基质、线粒体膜以及细胞核中；在中枢神经系统维持氧化与抗氧化平衡中起关键作用^[40-42]。既往研究证实过表达铜-锌超氧化物歧化酶可以减少谷氨酸诱导的神经元细胞毒性^[43-44]；此外，还有研究证实SOD缺乏的小鼠，缺血后导致的海马组织的延迟性损伤会显著的加重^[45]，SOD可以通过促进脑卒中后早期的AKT信号通路激活缓解DNA损伤^[46]；通过转导外源性SOD的铜伴侣蛋白(CCS)能显著增加了细胞中的内源性SOD活性，拮抗神经元死亡和缺血-再灌注损伤^[47]。目前SOD具体的酶激活机制还不清楚，铜离子对于铜-锌超氧化物歧化酶的功能至关重要，当缺乏铜离子后，酶的活性将彻底失活^[48-49]。但是当铜离子累积时，SOD的功能是否还能正常发挥抗氧化活性，是否可能存在抑制SOD酶的活性可能性，目前尚无研究证实。

3 铜死亡在脑卒中病程转归中的重要性

多项临床研究发现，血浆铜的基线水平与首次缺血性卒中的风险呈近似线性正相关性^[50-52]，铜离子的毒性/协同毒性作用参与了脑卒中在内的多种脑血管疾病的发生发展^[53-56]。目前已经明确铜离子广泛参与了脑卒中多个病理过程中，如血清铜、铜/锌、铜/硒的比例可反映急性缺血性脑卒中的氧化应激水平和脑细胞的营养状态^[57]，线粒体的氧化应激在脑卒中后缺血-再灌注损伤等多个过程均有出现^[58-60]。颅内血管堵塞引起供区脑组织的血流急剧下降，血流阻断4~10 min，会引起脑细胞死亡^[61-62]。脑细胞死亡方式中，坏死和凋亡是目前医学界的广泛共识，此外铁坏死、焦亡、自噬等新发现的细胞死亡方式也被证明参与其中，但铜死亡是否参与尚不可知^[62-64]。缺血引起脑细胞缺氧缺糖，导致线粒体ATP产生障碍，进而爆发级联反应如缺血-再灌注、炎症、氧化应激、离子稳态失衡等引起更为广泛的细胞死亡并持续影响神经元修复再生^{[58, 65-66]}。临床和基础研究均提示异常的血清铜可能是缺血性脑卒中细胞死亡的一个致病危险因素，且重点参与到氧化应激损伤过程。针对模仿铜离子在细胞内的运输过程，多种铜离子运载和结合药物用于治疗铜离子稳态失衡的疾病^[67-69]，而当部分铜离子转运药物治疗脑卒中时，可能存在抑制正常铜离子转移通道的可能，从而累加细胞铜离子主动和被动运输方式出现铜过载的结局；此外，内源性的铜离子稳态失衡，如细胞摄取过多或者排除受损导致细胞铜累积，内外因素共同作用引起铜稳态失衡最终可能导致铜死亡的发生^[70-71]。由于铜死亡的机制刚被解析清楚，尚没有直接证据表明铜死亡这种细胞死亡在脑卒中是否发生，以及是否加重了脑细胞的死亡，或者逆转铜死亡是否有助于脑卒中的预后，相关的研究均亟待开展。

总之，随着铜死亡具体机制的明确，铜累积是否参与卒中后神经细胞死亡及其具体作用机制，有望被快速阐释清楚。首先，脑卒中后确实出现了细胞铜吸收和外排稳态失衡；其次，缺血-再灌注损伤引起的氧化应激导致线粒体和DNA损伤已经被证实，且铜死亡主要发生在线粒体和三羧酸循环中；因此，铜死亡具备了“场地”和“佐证”，但铜死亡是否参与了脑卒中里的神经元坏死，目前缺乏直接的证据。此外，目前已经证实缺血-再灌注后线粒体产生大量的ROS直接导致了神经元的损伤，从铜死亡发生的线粒体呼吸依赖性方面推测，铜死亡有很大可能存在；最后，SOD酶对于降低氧化应激导致的细胞损伤具有重要作用，缺乏铜离子对于SOD正常功能的发挥举足轻重，但出现铜离子累积时SOD酶是否能继续发挥抗氧化应激作用尚不清楚。铜死亡作为一种新发现的细胞死亡方式，开展铜死亡在脑卒中神经细胞死亡的研究将为脑卒中的预防、治疗、康复提供新的破冰之举。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  王甜甜：文献查阅、构思，论文撰写；胡良聪：文献收集及整理，作图；樊红：综述框架设计、论文修改