心脏骤停（cardiac arrest, CA）是全世界的重大卫生问题^[1-2]。CA患者在心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation, CPR）后将经受以心脑为突出表现的多脏器缺血-再灌注损伤，导致复苏后的心脑功能障碍，成为影响患者存活及生存质量的最主要因素^[3-4]。丙戊酸钠（sodium valproate, VPA）临床上通常用作抗癫痫药物，近来研究显示也是一种非特异度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，具有减轻心、脑局部缺血-再灌注后损伤的作用^[5-6]，但对CPR后心脑损伤的保护作用少有报道。另外，研究发现内质网应激途径的细胞凋亡是复苏后心脑损伤的重要机制之一，成为复苏后心脑器官保护的潜在靶点^[7-8]。本研究拟建立猪CA复苏模型，观察VPA对复苏后心脑损伤的作用，以及对心脑组织中内质网应激途径细胞凋亡的影响，为进一步在临床的转化应用提供依据。

国产健康雄性白猪25头，体质量（37±3）kg，购自上海甲干生物科技有限公司，动物合格证号为SCXK（沪）2020-0006。动物采用随机数字表法分为假手术组（Sham, n=6）、CPR组（n=10）与CPR+VPA组（n=9）。Sham组仅进行动物准备，CPR组和CPR+VPA组建立猪CPR模型。其中CPR+VPA组在复苏后5 min经股静脉泵入VPA（美国Sigma公司）150 mg/kg、时长1 h，Sham组和CPR组同法泵入等量溶媒。该实验研究经浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会审批备案（批准号2020-148）。

主要仪器：iM60监护仪（深圳理邦公司），Monnal T75呼吸机（法国Air Liquide公司），手持式复苏循环监护仪和PalmCPR胸腔按压反馈仪（上海Sunlife公司），M Series除颤监护仪（美国ZOLL公司），压力监测导管（美国Edwards公司）。

主要试剂：替来他明/唑拉西泮（法国Virbac公司），噻拉嗪（吉林华牧动物保健公司），丙泊酚（西安力邦制药公司），心肌肌钙蛋白（cardiac troponin I, cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB, CKMB）、神经元特异度烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）和S100B蛋白（S100B protein, S100B）ELISA检测试剂盒（上海美轩生物公司），C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein, CHOP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase 12）和caspase 3一抗工作液（美国Proteintech公司），TUNEL检测试剂盒（武汉博士德生物公司）。

经肌肉注射替来他明/唑拉西泮5 mg/kg和噻拉嗪1 mg/kg诱导麻醉，再经耳缘静脉注射丙泊酚2 mg/kg全身麻醉、经股静脉继以4 mg/（kg·h）泵入维持麻醉状态。经口气管插管，连接呼吸机，参数设置为容量控制模式、潮气量10 ml/kg、吸呼比1∶2、氧体积分数21%，调节呼吸频率维持呼气末二氧化碳分压在35~40 mm Hg。切开皮肤直视下，经右侧股动、静脉分别置入一根压力监测导管直至胸主动脉与右心房位置，连续监测主动脉与右心房的压力。经右侧颈外静脉置入诱颤电极至右心室位置，用于诱导CA；经体表电极动态监测心电图。

参照笔者团队^[9]的方法制作猪CA复苏模型。首先经诱颤电极释放1 mA交流电诱发CA，确认成功后无干预观察9 min。参照指南标准实施CPR流程，即人工胸外按压和球囊辅助通气30: 2，应用Palm CPR装置实时监测反馈按压质量，保证按压深度5~6 cm、频率100~120次/min的高质量按压。CPR 2 min时，经静脉注射肾上腺素20 μg/kg，且每3 min重复1次。CPR 6 min时，经胸壁除颤1次，能量为150 J双向波，迅速判断自主循环恢复情况。若未恢复，迅速实施CPR流程2 min后除颤1次，反复该流程直至自主循环恢复、或5次后宣布复苏失败。对于自主循环恢复的动物，接上机械通气，连续监护4 h，撤机、拔除气管插管后送回猪圈观察20 h。

动态监测心率、血压、体温等生理指标的变化，记录动物的复苏成功率与24 h存活情况。于造模前及复苏后1 h、2 h、4 h和24 h，经股静脉采集血液标本2 ml，离心获取上清液，置于-80℃深低温冰箱保存，择期应用ELISA法检测心脑损伤标志物cTnI、CKMB、NSE和S100B的血清浓度。

复苏后24 h时，每组随机选6头猪实施安乐死，迅速获取左室心肌与大脑额叶皮层组织标本，部分标本置于-80℃深低温冰箱保存，择期应用western blot法检测CHOP、caspase 12和caspase 3的蛋白表达水平。主要操作过程如下：组织样本进行裂解，4℃下10 000 g离心10 min，获取上清液测浓度，经SDS-PAGE蛋白电泳、PVDF转膜、5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入CHOP、caspase 12和caspase 3一抗工作液（均按1∶1000稀释）在4℃下孵育过夜，再加入山羊抗兔二抗室温孵育1 h，然后在ECL下显影拍照，应用Image J软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白与GAPDH灰度比值为蛋白表达水平。

另外，部分组织标本择期应用TUNEL法检测细胞凋亡情况。流程如下：经4%福尔马林固定、石蜡包埋、切片等步骤制作病理切片，应用TUNEL试剂盒进行凋亡细胞染色，再置于200倍光镜下拍照，每张切片随机选择5个视野，计算每个视野中棕黄色阳性细胞与总细胞的比例，以5个视野结果的平均值为细胞凋亡指数。

应用SPSS 20.0统计软件（美国IBM公司）进行数据统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，三组间比较采用单因素方差分析。计数资料以百分率表示，两组间比较采用精确检验法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

本研究共使用实验猪25头。三组动物基础状态下的血压、心率、体温及心脑损伤标志物均为正常水平。造模期间，CPR组10头与CPR+VPA组9头分别复苏成功9头和7头，CPR组在11 h和20 h死亡各1头，两组复苏成功率分别为90.0%与77.7%（P > 0.05），24 h存活率分别为70.0%与77.7%（P > 0.05）。

与Sham组相比，CPR组和CPR+VPA组复苏后心率增快、血压下降，其中各时间点的心率比较，组间差异有统计学意义（均P < 0.05）。与CPR组相比，CPR+VPA组复苏后心率较慢、血压较高，组间比较差异无统计学意义（均P > 0.05，图 1）。

HR：心率；MAP：平均动脉压；BL：基线；Sham：假手术；CPR：心肺复苏；VPA：丙戊酸钠; 与Sham组比较，aP < 0.05 图 1 各组动物血流动力学参数的变化 Fig 1 The changes of hemodynamics in each group

图选项

与Sham组相比，CPR组和CPR+VPA组复苏后心肌损伤标志物cTnI和CKMB的血清浓度明显升高（均P < 0.05）。与CPR组相比，CPR+VPA组cTnI在复苏1 h后、CKMB在复苏2 h后的血清浓度显著降低（均P < 0.05，表 1）。

与Sham组相比，CPR组和CPR+VPA组复苏后脑损伤标志物NSE和S100B的血清浓度明显升高（均P < 0.05）。与CPR组相比，CPR+VPA组NSE在复苏1 h后、S100B在复苏2 h后的血清浓度显著降低（均P < 0.05，表 2）。

与Sham组相比，CPR组和CPR+VPA组复苏后心脑组织内质网应激凋亡相关蛋白CHOP、caspase 12和caspase 3的表达水平明显增加（均P < 0.05）。与CPR组相比，CPR+VPA组复苏后心脑组织CHOP、caspase 12和caspase 3的表达水平显著减少（均P < 0.05，图 2）。

CHOP：C/EBP同源蛋白；caspase 12：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12；caspase 3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；Sham：假手术；CPR：心肺复苏；VPA：丙戊酸钠。与Sham组比较，aP < 0.05；与CPR组比较，bP < 0.05 图 2 各组动物心脑组织CHOP、caspase 12与caspase 3蛋白表达水平的变化 Fig 2 The changes of CHOP, caspase 12, and caspase 3 expression in myocardium and brain cortex in each group

图选项

与Sham组相比，CPR组和CPR+VPA组复苏后心脑组织细胞凋亡指数明显升高（均P < 0.05）。与CPR组相比，CPR+VPA组复苏后心脑组织细胞凋亡程度显著降低（均P < 0.05，图 3）。

Sham：假手术；CPR：心肺复苏；VPA：丙戊酸钠。与Sham组比较，aP < 0.05；与CPR组比较，bP < 0.05 图 3 各组动物心脑组织细胞凋亡指数的变化（×200） Fig 3 The changes of apoptosis indexes in myocardium and brain cortex in each group (×200)

图选项

VPA一直是临床上用于抗癫痫和稳定情绪的重要一线药物^[10]。近年来研究发现，VPA作为一种短链脂肪酸，具有抑制Ⅰ类和Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶的药物活性，从而在基因的转录和表达调控方面发挥重要作用^[11]。越来越多的研究显示，VPA具有减轻局部或系统性缺血-再灌注后心脑器官损伤的保护效应。2019年，有研究^[5]建立大鼠急性心肌梗死模型，发现VPA能将心肌梗死面积缩小50%，显著改善心肌收缩功能状态，其保护机制与激活Foxm1信号通路后减轻炎症反应、氧化应激等病理损伤有关。同年，有研究^[6]制作沙鼠全脑缺血-再灌注损伤模型，发现VPA能通过抑制细胞凋亡而减轻神经元损伤，进而改善脑缺血-再灌注后认知功能障碍。另外，有研究^[12]在大鼠失血性休克模型中，发现VPA能通过激活Akt/Bcl-2信号通路而促进心肌细胞存活，并改善动物生存状态。Bhatti等^[13]利用猪失血性休克模型，发现VPA能调控受损脑组织中代谢谱的变化，包括不饱和脂肪酸合成增加、兴奋性氨基酸水平下降等，从而营造神经保护性微环境，最终促进神经损伤修复。在CPR领域，有研究^[14]发现VPA能通过上调组蛋白H3乙酰化水平而促进亚低温治疗条件下HSP70基因的转录增加，增强HSP70介导的抗凋亡效应，从而改善窒息性CA大鼠的神经功能预后与存活结局。然而，VPA对CPR后心脑损伤的保护作用有待进一步证实，相应的作用机制及临床前效果验证有待明确。

针对上述问题，本研究选择与人类解剖、生理等参数相近的实验猪^[15]，开展VPA在复苏领域应用的临床前探索。首先，鉴于CA事件发生的不确定性，结合临床可行的干预时机^[16]，选择在复苏成功后5 min开始VPA治疗。其次，参照VPA在局部或系统性缺血-再灌注损伤研究中的药物使用剂量^{[5-6, 12-14]}，笔者选择在1 h内经静脉泵入150 mg/kg的用药方法。结果显示，在经历CA和复苏的过程后，CPR组和VPA+CPR组动物心脑损伤标志物cTnI、CKMB、NSE和S100B的血清浓度明显升高，提示CA复苏猪心脑损伤的模型制备成功。与CPR组相比，应用VPA治疗后，复苏1 h后的cTnI和NSE血清浓度显著降低、复苏2 h后的CKMB和S100B血清浓度显著下降，提示VPA具有减轻猪复苏后心脑损伤的作用。

目前，临床上丙戊酸钠的常用剂量为15~30 mg/（kg·d），摄入过量时可致中枢神经系统异常、呼吸循环抑制、肝肾损伤、电解质紊乱等，其对人的半数致死量为8~10 g、极限致死剂量为15 g左右^[17-18]。在当前研究中，VPA 150 mg/kg的应用剂量明显高于临床常用剂量，如果要进行临床转化研究，必须确定合理的剂量并充分评估大剂量使用的安全性问题。

机体经历CA事件后，系统性缺血-再灌注将启动炎症反应、氧化应激、钙超载等病理损伤途径，进一步地诱导细胞发生多种形式的程序性细胞死亡，成为复苏后心脑等多器官损伤与功能障碍的重要原因^[19-20]。然而，目前已报道的一些复苏后心脑保护的方法，虽能靶向上述病理损伤途径而减轻复苏后心脑损伤，但尚未能在临床中得以成功的转化应用^[21-22]。

近年来，研究发现内质网应激是死亡受体途径与线粒体途径以外的另一重要的细胞凋亡启动途径，在局部缺血-再灌注后心脑组织细胞凋亡的调控过程中发挥重要作用^[23-24]。已有研究报道，内质网应激凋亡途径也参与复苏后心脑器官的损伤过程。在大鼠复苏模型中，CPR后受损心肌组织中内质网CHOP信号通路激活并启动细胞凋亡过程，山莨菪碱能通过抑制CHOP信号途径而减轻心肌细胞凋亡^{[7, 25]}。研究还显示，大鼠CPR后脑组织中CHOP、caspase 12等内质网蛋白表达上调，应用内质网应激抑制剂salubrinal或Sigma-1受体激动剂cutamesine均能通过抑制CHOP-caspase 12-caspase 3通路介导的神经元凋亡，进而促进神经功能恢复^[8]。

本研究同样观察到复苏后受损心脑组织中CHOP、caspase 12与caspase 3蛋白表达增加、细胞凋亡指数上升，提示复苏后心脑组织存在内质网应激介导的细胞凋亡。在进行VPA干预后，上述蛋白表达减少、细胞凋亡减轻，由此提示内质网应激凋亡途径可能是VPA保护复苏后心脑损伤的机制之一。

本研究有一些局限性。首先，研究虽发现VPA具有复苏后心脑保护作用，但其干预的有效时机、给药方式、剂量范围及安全性等问题仍有待确认。其次，整个实验观察周期仅24 h，且在实验终点时仍存在严重的心脑损伤，将来需选择更长的实验时长来充分评估VPA的心脑保护作用。再者，研究发现VPA具有抑制内质网应激凋亡途径的作用，但其表观遗传调控的机制仍有待阐明。

综上所述，VPA具有减轻猪复苏后心脑损伤的作用，其机制可能与抑制内质网应激途径介导的细胞凋亡过程有关。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明  邵雪波、余倩、陈琪、刘英、徐杰丰、周光居：实验操作；邵雪波、唐卫东：论文撰写、数据收集及整理、统计学分析；张茂：研究设计、论文修改