2022, Vol. 31
2. 宁波大学医学院, 宁波 315211
2. School of Medicine, Ningbo University, Ningbo 315211, China
急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是一种威胁生命的疾病，与脓毒症、休克、创伤、烧伤、或急性重症胰腺炎等有关，其最常见的病因是感染，其特征在于非心源性肺水肿、呼吸窘迫、低氧血症等[1-2]。严重的ALI可导致急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS），表现为肺顺应性降低、顽固性低氧血症、呼吸衰竭等。近年来，对ALI/ARDS的定义、发病机制和诊治的研究取得了很大进展，但由于其发病机制尚不完全明确，治疗仍较为困难[3]。
1-磷酸硝胺醇受体（sphingosine 1-phosphate receptors, S1PRs）是一类跨膜的G蛋白偶联受体，其配体是S1P。S1P-S1PRs信号通路激活后，可调节血管生成、细胞增殖和机体炎症反应等，参与到多种疾病的病理生理过程中[4]。S1PR3是S1PRs家族的重要成员，在单核/巨噬细胞细胞膜上高表达[5]。本课题组前期研究表明，S1PR3在巨噬细胞对细菌清除中发挥了重要作用[6]。本研究通过设计、合成新型的S1PR3特异性激动剂GPS-725.017，探讨GPS-725.017对ALI的保护作用及其分子机制。
1 材料与方法 1.1 主要材料与主要试剂 1.1.1 实验动物6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，健康清洁级，体重20~24 g，60只（购自上海斯莱克实验动物有限公司）。
1.1.2 主要试剂大肠杆菌（E.coli）菌株（ATCC 25922）用于构建小鼠急性肺损伤模型；GPS-725.017购自金斯瑞生物科技有限公司；DMEM细胞培养基（Gibco，美国）用于培养小鼠肺脏巨噬细胞；二甲亚砜（国药, 中国）用于溶解GPS-725.017；磷酸盐缓冲液（上海语纯，中国）用于肺脏灌洗；氯化钠（国药，中国）、胰蛋白胨（Thermo Oxoid，美国）、酵母提取物（Thermo OXOID，美国）、琼脂粉（国药，中国）等用于配置细菌培养基；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）试剂盒，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白介素IL-1β（Interleukin-1β, IL-1β），购自联科生物。
1.2 实验方法 1.2.1 GPS-725.017的设计3个氨基酸（RPY）结构来源于S1PR3胞内的第二个环。对该短肽的结构进行重新设计：将正亮氨酸（Norleucine, Nle）和肉豆蔻酸（myristic acid, myr）加于该短肽的N端，中间以甘氨酸（G）连接，C端酸化修饰，结构序列为Myr-G-Nle-R-P-Y-NH2，合成后溶解于二甲亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）中[7]。
1.2.2 构建小鼠肺损伤的实验模型及分组随机将实验小鼠分为三组，假手术组、溶剂组和GPS-725.017治疗组，每组小鼠数目根据实验目的确定（n=5或10）。溶剂组和GPS-725.017治疗组小鼠气管内注射50 μL大肠杆菌（5×106 CFU），诱导ALI模型[8]；假手术组只给予50 μL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer, PBS）。造模后，GPS-725.017治疗组再给予GPS-725.017。溶剂组、假手术组只给予相同体积的溶剂。
1.2.3 GPS-725.017治疗和生存率观察小鼠ALI模型建立后，GPS-725.017治疗组立即气管内给予GPS-725.017（按10 mg/kg）。溶剂组及假手术组给予相同体积的溶剂。各组经上述处理后，连续48 h观察小鼠存活情况（n=10）。
1.2.4 外周血及肺脏细菌负荷及炎性因子检测假手术组、GPS-725.017治疗组及溶剂组（每组n=5）分别于ALI模型后5 h，按400 mg/kg的剂量通过腹腔注射麻醉剂（4%水合氯醛），进行麻醉。采用心脏釆血法，收集小鼠全血于抗凝管。抽取500 μL PBS对小鼠进行支气管肺泡灌洗，连续3次。将所得全血以及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）进行梯度稀释，LB平板涂板，置于37℃培养箱中，过夜培养，并计数细菌，计算出单位体积血液或肺泡灌洗液中CFU。利用ELISA试剂盒检测各组小鼠血液及肺泡灌洗液中炎性因子的含量。
1.2.5 肺泡灌洗液中巨噬细胞提取小鼠ALI模型5 h后取BALF，350 g离心5 min，弃上清液，细胞用10 mL PBS重悬，并用PBS清洗细胞2次。清洗完毕后，用DMEM培养基将细胞重悬，接种到细胞培养瓶内，于37℃，5% CO2培养箱中孵育1.5~2 h，使细胞贴壁。孵育完毕后，去除上清中未贴壁细胞，加入2mL DMEM培养基清洗细胞，重复2~3次。培养瓶中加1 mL PBS（含5 mmol/L EDTA）消化细胞，孵育5 min，收集细胞悬液，紧接着移液，加入1 mL DMEM培养基冷浸。
1.2.6 Western blot法测定肺泡巨噬细胞内Vps34蛋白含量测定将上述各组别分离出的肺泡巨噬细胞计数，调整细胞数目为2×106置于EP管中，加入RIPA裂解液（含1% PMSF），冰上操作，每隔5 min充分震荡EP管，离心（14 000 r/min，4℃，15 min），吸取上清液，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），转膜，用抗Vps34（1∶1 000，Santa Cruz，USA）、抗β-actin（1∶2 000，Santa Cruz，USA）于4℃过夜孵育，然后加二抗室温下孵育2 h，ECL试剂显色，通过JY-Clear ECL型化学发光成像系统对各蛋白进行显影。Image J软件定量分析蛋白条带。
1.2.7 肺组织的采集及病理学检测假手术组、GPS-725.017治疗组和溶剂组小鼠（每组n=5）分别在模型后12 h，按400 mg/kg的剂量通过腹腔注射麻醉剂（4%水合氯醛），进行麻醉；提取小鼠肺脏组织。取某一肺叶于4%多聚甲醛中固定，制作石蜡切片，并使用苏木精-伊红（hematoxylin eosin stain, H & E）进行染色。将小鼠肺脏组织切片于显微镜下拍照，并对肺脏损伤情况进行评分。评分标准如下：1分，正常；2分，为肺间质炎症细胞浸润 < 50%；3分，肺间质炎症细胞浸润 > 50%；4分，肺脏实变并炎症细胞浸润 < 50%；5分，肺脏实变并炎症细胞浸润 > 50%[8-9]。利用统计软件对各组小鼠评分进行分析。
1.3 统计学方法使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析，生存率采用对数秩检验（Log-rank test）进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间数据采用one-way ANOVA进行检验分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 S1PR3特异性激动肽GPS-725.017的设计及结构序列源于S1PR3胞内第二个环的特异性激动肽KRX 725的氨基酸序列是（143 M-R-P-Y-D-A-N-K-R 151）。前期研究证明，该短肽能特异性激活S1PR3，增强巨噬细胞对细菌的清除作用，改善脓毒症小鼠预后[9]。在此研究基础上重新设计，以3个氨基酸核心序列（144 R-P-Y 146）为母核结构，N末端连接一个非天然氨基酸Nle，组成Nle-R-P-Y短肽，进一步将myr加于该肽的N端，C末端进行酸化修饰，设计得到一种新的结构序列（Myr-G-Nle-R-P-Y-NH2），并命名为GPS-725.017[7]。具体结构序列见表 1。
| 名称 | 氨基酸序列 |
| KRX-725 | 143 M-R-P-Y-D-A-N-K-R 151 |
| GPS-725.017 | Myr-G-Nle-R-P-Y-NH2 |
建模及治疗后48 h，GPS-725.017治疗组小鼠（n=10）生存率显著高于溶剂组（P < 0.01），见图 1。
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| 建模及治疗后48 h，GPS-725.017治疗组小鼠生存率显著高于溶剂组（n=10），aP < 0.01；Vehicle为溶剂组、GPS-725.017为GPS-725.017治疗组、Sham为假手术组 图 1 感染小鼠生存率分析 Fig 1 Kaplan-Meier survival analysis of infected mice |
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为评估ALI小鼠肺脏细菌感染的情况，在GPS-725.017干预后5 h，采集假手术组、溶剂组和GPS-725.017治疗组（n=5）小鼠的全血及肺泡灌洗液，计数细菌量。如图 2，溶剂组和GPS-725.017治疗组小鼠肺脏及血液细菌负荷较假手术组明显增加，GPS-725.017治疗组肺泡灌洗液和血液中的细菌量均显著低于溶剂组（P < 0.001）。
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| 建模及治疗后5 h，溶剂组和GPS-725.017治疗组小鼠肺脏及血液细菌负荷较假手术组明显增加（n=5），aP < 0.001；GPS-725.017治疗组血液中和肺泡灌洗液中的CFU值显著低于溶剂组（n=5），aP < 0.001；Vehicle为溶剂组、GPS-725.017为GPS-725.017治疗组、Sham为假手术组 图 2 感染小鼠肺泡灌洗液和血液细菌负荷 Fig 2 Bacterial burden of bronchoalveolar lavage fluid and blood in infected mice |
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为明确GPS-725.017对ALI小鼠肺脏损伤严重程度的影响，GPS-725.017治疗后5 h取各组小鼠（n=5）外周血及肺泡灌洗液，对小鼠外周血及肺泡灌洗液中的炎性因子TNF-α、IL-1β水平进行检测。如图 3所示，溶剂组和GPS-725.017治疗组小鼠外周血及肺泡灌洗液中的炎性因子TNF-α、IL-1β水平较假手术组明显上调，GPS-725.017治疗组血液和肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β水平均显著低于溶剂组（P < 0.001）。
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| 建模及治疗后5 h，溶剂组和GPS-725.017治疗组小鼠外周血及肺泡灌洗液中的炎性因子TNF-α、IL-1β水平较假手术组明显上调，GPS-725.017治疗组血液中的TNF-α、IL-1β水平显著低于溶剂组，aP < 0.001；GPS-725.017治疗组的肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β水平也均明显低于溶剂组，aP < 0.001；Vehicle为溶剂组、GPS-725.017为GPS-725.017治疗组、Sham为假手术组 图 3 感染小鼠肺泡灌洗液和血液炎症因子水平 Fig 3 Levels of the proinflammatory cytokines of bronchoalveolar lavage fluid and blood in infected mice |
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溶剂组和GPS-725.017治疗组小鼠肺泡巨噬细胞内Vps34蛋白表达水平在造模后较假手术组均明显上调（n=3），且GPS-725.017治疗组肺泡巨噬细胞内Vps34蛋白表达水平明显高于溶剂组，差异具有统计学意义（P < 0.01）。见图 4。
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| 建模及治疗后5 h，提取肺泡灌洗液中巨噬细胞，溶剂组和GPS-725.017治疗组小鼠肺泡巨噬细胞内Vps34蛋白表达水平在造模后较假手术组均明显上调，GPS-725.017治疗组肺泡巨噬细胞内Vps34蛋白表达水平明显高于溶剂组，bP < 0.01 图 4 肺泡巨噬细胞Vps34蛋白表达水平 Fig 4 Vps34 protein expression level of alveolar macrophages in vitro |
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为评估GPS-725.017对ALI小鼠肺脏损伤的改善情况，在GPS-725.017治疗后12 h取某一肺叶于4%甲醛固定、制作切片以及进行H & E染色，显微镜下拍照后对肺脏进行组织学评分（n=5）。结果发现，溶剂组有明显ALI的病理改变，包括弥漫性肺泡损伤、肺泡充血、大量炎症细胞浸润等；GPS-725.017治疗后肺损伤明显减轻，差异具有统计学意义（P < 0.001）。见图 5。
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| 建模及治疗后12 h，取肺组织H & E染色，溶剂组有明显ALI的病理改变，包括弥漫性肺泡损伤、肺泡充血、大量炎症细胞浸润等；GPS-725.017治疗后肺损伤明显减轻，bP < 0.001；Vehicle为溶剂组、GPS-725.017为GPS-725.017治疗组、Sham为假手术组；标尺为50 μm 图 5 急性肺损伤小鼠肺脏病理学评分 Fig 5 Lung injury of ALI mice |
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Hou等[6]前期研究提示，巨噬细胞S1PR3在细菌清除中发挥重要作用，S1PR3的激活促使了空泡分选蛋白34（vacuolar protein sorting 34, Vps34）招募到巨噬细胞早期吞噬体，使磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）磷酸化成3-磷酸磷脂酰肌醇[（phosphatidylinositol-3-phosphate, PtdIns(3)P）]，通过磷酸化使PtdIns (3)P的FYVE结构域和PX结构域改变，募集早期内体抗原分子1（Early endosomes antigen 1，EEA1）等关键调节因子，进而调控了吞噬体的成熟，从而增强巨噬细胞杀菌作用[10-13]。“S1PR3-G protein-Vps34-EEA1信号通路”调控巨噬细胞吞噬体功能，影响脓毒症预后。由此提示，S1PR3是治疗细菌感染的重要靶点，特异性S1PR3激动肽可能是治疗急性肺损伤的潜在药物。课题组前期研究表明，源于S1PR3胞内第二个环的特异性激动肽KRX 725（143 M-R-P-Y-D-A-N-K-R 151）可特异性激活S1PR3，上调细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal Regulated Kinase, ERK）磷酸化水平，提高巨噬细胞清除细菌的能力，改善脓毒症小鼠预后[9]。但该多肽存在跨膜入胞时间较长，结构不稳定、容易被降解等缺点。课题组前期另一项研究也证实，3个同源于S1PR3胞内第二个环的核心氨基酸序列（144 R-P-Y 146）是KRX725发挥作用的核心序列。在此基础上，将核心氨基酸序列的N端连接一个非天然氨基酸Nle，组成Nle-R-P-Y短肽，在该肽N端增加了9个精氨酸合成的另一种S1PR3特异性激动肽RY-15[14]。研究证实，RY-15可以进入到巨噬细胞内，特异性激动S1PR3，从而促进巨噬细胞清除细菌作用[15]。虽然RY-15的入胞及激动效能有所增强，但是9个精氨酸修饰也增加了多肽的正电荷从而增加了细胞毒性。
本研究对前期的多肽进一步优化，在Nle-R-P-Y短肽基础上，在其N末端连接一个myr，C端酸化修饰，生成一种新型的S1PR3激动肽，并命名为GPS-725.017。前期体外研究证明，GPS-725.017通过调控S1PR3，活化下游MAPKs通路，具有较强的激动作用[7]，然而在体内的作用并不明确。本研究模拟临床患者感染性肺炎所致ALI的发病过程，通过向小鼠气管内注射大肠杆菌，诱导ALI模型[16]，以证实GPS-725.017对细菌性肺损伤小鼠的治疗作用。研究结果显示：建模及治疗后48 h，GPS-725.017治疗组小鼠生存率显著高于溶剂组；GPS-725.017治疗5 h后，GPS-725.017治疗组小鼠肺脏及外周血细菌负荷更少，肺脏炎症因子及病理学损伤程度水平更低。在相关杀菌分子机制研究方面，GPS-725.017组小鼠的肺泡巨噬细胞内Vps34蛋白表达水平明显上调。
然而本实验也存在一些局限性。首先，本实验未进行药物的毒性实验、药代动力学实验及与S1PR3结合亲和力测试实验，而这些研究对于该多肽的临床转化具有重要意义。其次，本研究采用细菌的大肠杆菌，是革兰氏阴性菌，还未选取常见的革兰氏阳性菌等其他菌属进行实验，仍需进一步探究验证。
综上所述，本研究认为，GPS-725.017可以明显减轻ALI小鼠的肺部损伤程度，显著提高ALI小鼠的生存率，具体的作用机制为：该多肽特异性激动肺泡巨噬细胞膜上S1PR3受体，进而上调胞内Vps34蛋白表达水平，从而促进肺泡巨噬细胞清除细菌。本研究为ALI的治疗提供了一种新的方法，但GPS-725.017作为一种新型药物，其安全性、药代动力学以及与S1PR3结合的参数仍有待于进一步研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 郑君刚：总体负责实验设计、实验实施、数据分析以及论文撰写；杨余、许晶晶：参与实验实施和数据分析；李勇、张鹏杰、王俊、卢子会：参与数据分析和论文撰写；黄长顺：参与实验设计；曹刚：参与论文撰写；所有作者参与定稿
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