2022, Vol. 31
急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是临床上常见的急性呼吸系统疾病，主要表现为肺泡通透性增加、严重肺泡水肿和呼吸衰竭[1]。脓毒血症是严重创伤、感染、休克后常见的并发症，也是临床上引起ALI最常见的诱因之一。目前ALI的发病机制尚不完全清楚，缺乏有效的防治措施。
铁死亡作为一种独特的程序性细胞死亡方式，以脂质过氧化增加，铁代谢及抗氧化应激紊乱为主要特征[2]。既往研究发现，ALI患者肺组织存在铁过载[3]，导致炎症反应、氧化应激和线粒体功能障碍[4]，并最终通过铁死亡加重肺损伤。在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的ALI中，铁死亡明显增加[5-6]，表明铁死亡在LPS诱导的ALI的发病机制中发挥着非常重要的作用。
衣康酸是巨噬细胞在LPS刺激后产生的代谢产物，在调控巨噬细胞抗炎和代谢重编程方面具有重要的作用[7]。4-辛基衣康酸（4-octyl itaconate, 4-OI）是一种外源性衣康酸衍生物，可以通过烷基化修饰，抑制核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）的降解，从而增加具备抗氧化和抗炎能力的下游基因的表达[8]。而Nrf2作为调节铁稳态和脂质过氧化相关基因的转录因子之一，发挥着重要的铁死亡调控作用[9]。因此猜测4-OI可以通过介导Nrf2调控铁死亡进而减轻LPS诱导的ALI，本文拟探讨其保护作用及具体机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与材料大肠杆菌O111:B4产LPS（#L2630）购自美国Sigma-Aldrich公司，4-OI、去铁酮（deferiprone, DFP）购自上海MCE公司，一抗铁蛋白重链（ferritin heavy chain, FTH1）（A1144）购自中国Abclonal公司，Nrf2（16396-1-AP）、GPX4（14432-1-AP）、β-actin（60008-1-Ig）、山羊抗兔二抗（PR30009）均购自武汉Proteintec公司，4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal, 4-HNE）（bs-6313R）购自北京Biosss公司，丙二醛（malondialdehyde, MDA）检测试剂盒（A003-1-2）和组织铁检测试剂盒（A039-2-1）均购自南京建成生物，RIPA裂解液（G2002）、RNA提取液（G3013）、逆转录试剂盒（G3330）、实时PCR（real-timePCR, RT-PCR）试剂盒均购自武汉Servicebio公司。
1.2 方法 1.2.1 ALI动物模型构建6~8周龄雄性C57/BL6小鼠30只，均购自武汉疾病预防控制中心实验动物中心，适应性喂养3 d后，随机分为对照组、4-OI组、LPS组、4-OI+LPS组和DFP+LPS组，每组6只，除DFP外均采用腹腔注射给药方式[10-11]，对照组小鼠给予无菌PBS（25 mL/kg）；4-OI组给予4-OI（25 mg/kg）；LPS组给予LPS（10 mg/kg）；4-OI+LPS组预先给予4-OI（25 mg/kg），2 h后再给予LPS（10 mg/kg）。150 mg/(kg·d) DFP溶解于小鼠饮用水中[12]，喂养两周后再给予LPS（10 mg/kg）造模。所有小鼠在给予造模处理12 h后统一异弗烷吸入麻醉后断颈处死，处死后称重，收集双侧肺组织并称重，部分左肺利用甲醛固定，其余肺组织置于液氮快速冷冻后转移至-80 ℃保存。所有关于动物实验的操作流程均符合美国国立卫生院出版的《实验室动物的伦理和使用指南》，并获武汉大学人民医院动物伦理和使用委员会批准（审批号：20210305）。
1.2.2 病理染色及肺损伤评分小鼠左肺经4%甲醛溶液固定48 h后石蜡包埋切片，切片后分别进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin, HE）和Masson染色，染色完成后观察拍照并进行肺损伤评分，参考目前研究中最常用的肺损伤评分标准[13]，通过半定量评分系统来进行评分，对炎症、水肿、出血和肺泡间隔增厚分别进行0~4分评分：通过计算炎症细胞数目来评估炎症；每张切片上随机计数5~7个视野。水肿、出血分为无肺泡（0分）、轻度（< 10%的肺泡，1分）、中度（10%~30%的肺泡，2分）、重度（30%~50%的肺泡，3分）和极重度（>50%的肺泡，4分）。对肺泡间隔增厚的测量和分类如下：正常（肺泡间隔厚度 < 15 μm，0分）、轻度（肺泡间隔厚度在15~29 μm，1分）、中度（肺泡间隔厚度在30~44 μm，2分）、重度（肺泡间隔厚度在45~60 μm，3分）和极重度（肺泡间隔厚度在60 μm以上，4分）。对每组的炎症、水肿、出血和肺泡间隔增厚评分取平均值，最终评分代表所有四个损伤参数的总体评估。
1.2.3 免疫组织化学染色取肺组织石蜡切片，60 ℃烘箱拷片至少30 min，用二甲苯和酒精依次进行脱蜡水化，抗原修复，3%双氧水封闭后PBS漂洗，加一抗（1︰100），4 ℃孵育过夜，复温30 min后漂洗，滴加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，室温孵育30 min后漂洗，滴加DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，透明并封片，置于镜下观察拍照。
1.2.4 组织免疫荧光染色取肺组织石蜡切片，60 ℃烘箱烤片至少30 min，用二甲苯和酒精依次进行脱蜡水化，抗原修复，Triton X-100通透，10%驴血清封闭后，加一抗（1︰100）孵育过夜，复温后漂洗，二抗（1︰200）避光孵育1 h，DAPI避光封片，置于荧光显微镜下观察拍照。
1.2.5 蛋白质免疫印迹检测取冰冻小鼠肺组织，称重后，按比例加入RIPA裂解液，液氮冷冻研磨1 min，离心后取上清，超声裂解后再次离心，取上清后利用BCA法检测蛋白浓度，调整浓度后进行蛋白变性。利用SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳，采用PVDF膜进行转膜，5%脱脂牛奶封闭3 h，一抗（1︰1000）孵育过夜，二抗室温封闭2 h，利用ECL化学发光法扫膜并分析结果。
1.2.6 实时定量PCR检测取冰冻肺组织，利用Trizol法提取总mRNA，逆转录合成cDNA，分别加入引物，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，检测各基因mRNA表达水平，相关引物序列见表 1。
| 基因名称 | 引物序列（5’-3’） | 种属 |
| IL-6 | 正向引物：CCCCAATTTCCAATGCTCTCC | 小鼠 |
| 反向引物：CGCACTAGGTTTGCCGAGTA | ||
| IL-1β | 正向引物：TCAAATCTCGCAGCAGCACATC | 小鼠 |
| 反向引物：CGTCACACACCAGCAGGTTATC | ||
| TNF-α | 正向引物：GTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTC | 小鼠 |
| 反向引物：GTTTGTGAGTGTGAGGGTCTGG | ||
| PTGS2 | 正向引物：GAAATATCAGGTCATTGGTGGAGA | 小鼠 |
| 反向引物：ATGCTCCTGCTTGAGTATGTCG | ||
| FTH1 | 正向引物：GATGTGGCTCTGAAGAACTTTGC | 小鼠 |
| 反向引物：CAGTCATCACGGTCTGGTTTCT | ||
| GPX4 | 正向引物：GCTGGGAAATGCCATCAAAT | 小鼠 |
| 反向引物：TCCTTCTCTATCACCTGGGGCT | ||
| β-actin | 正向引物：GTCCACCGCAAATGCTTCTA | 小鼠 |
| 反向引物：TGCTGTCACCTTCACCGTTC | ||
| 注：IL-6为白介素6，IL-1β为白介素1β，TNF-α为肿瘤坏死因子α，PTGS2为前列腺素内过氧化物合酶2，FTH1为铁蛋白重链，GPX4为谷胱甘肽过氧化物酶4，β-actin为肌动蛋白（内参） | ||
使用SPSS 23.0和GraphPad Prism 8软件完成所有统计学分析，计量资料统计前进行方差齐性检验，符合正态分布的计量资料采用均值±标准差（x±s）表示，多组间差异比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 4-OI显著减轻LPS诱导的ALI与对照组相比，LPS造模组小鼠肺组织病理损伤及胶原沉积明显加重，肺损伤评分显著升高（P < 0.05）。而4-OI+LPS组相比于LPS组，小鼠肺损伤情况明显改善，肺湿干重比明显降低，肺组织含水量明显减少，差异具有统计学意义（均P < 0.05），见图 1。
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| A：各组小鼠肺组织HE和Masson染色（×400）；B：根据HE染色切片，对各组小鼠肺组织进行半定量肺损伤评分；C：各组小鼠肺组织湿干重比；4-OI为4-辛基衣康酸，LPS为脂多糖；与对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.05 图 1 4-OI显著减轻LPS诱导的ALI Fig 1 4-OI significantly reduced LPS-induced ALI |
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LPS组小鼠肺组织炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α相对水平显著高于对照组。相比于LPS组，4-OI+LPS组炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α显著降低，差异具有统计学意义（均P < 0.05，表 2），4-OI显著改善了LPS诱导的小鼠肺部炎症水平。
| 组别 | IL-1β | IL-6 | TNF-α |
| 对照组 | 1.00±0.07 | 1.01±0.16 | 1.00±0.04 |
| 4-OI组 | 1.11±0.19 | 1.06±0.19 | 1.27±0.08 |
| LPS组 | 32.65±4.49a | 12.22±0.91a | 38.53±2.31a |
| 4-OI+LPS组 | 4.38±0.47b | 3.97±0.64b | 15.06±2.26b |
| 注：IL-6为白介素6，IL-1β为白介素1β，TNF-α为肿瘤坏死因子α；与对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.05 | |||
与对照组相比，LPS刺激显著增加了小鼠肺组织的脂质过氧化水平，免疫组化染色示内源性脂质过氧化产物4-HNE明显增多，脂质过氧化代谢产物MDA水平显著升高，组织铁水平明显升高，铁死亡标志物PTGS2 mRNA水平也显著增加，差异具有统计学意义（均P < 0.05）；4-OI+LPS组上述指标受到4-OI的抑制，明显低于LPS组，差异具有统计学意义（均P < 0.05），见图 2。
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| A：各组小鼠肺组织4-HNW免疫组化（×400）；B：ELISA法检测各组小鼠肺组织MDA水平；C：ELISA法检测各组小鼠肺组织铁水平；D：RT-PCR检测铁死亡相关基因PTGS2 mRNA相对表达水平；与对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.05 图 2 4-OI抑制肺组织脂质过氧化 Fig 2 4-OI inhibited the lipid peroxidation of lung tissue |
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小鼠肺组织免疫荧光染色显示，与对照组相比，LPS组小鼠肺部FTH1表达显著降低；而在给予4-OI治疗的4-OI+LPS组中，LPS刺激导致的FTH1减少被4-OI明显逆转。免疫蛋白印迹结果显示，LPS组中三种抑制铁死亡的重要蛋白Nrf2、FTH1和GPX4表达明显低于对照组，而4-OI+LPS组的上述指标较LPS组明显升高。PCR的结果呈现出与免疫蛋白印迹结果相同趋势，差异具有统计学意义（均P < 0.05），见图 3。为进一步验证4-OI是否通过抑制铁死亡减轻LPS诱导的肺损伤，利用铁螯合剂DFP预治疗后再给予LPS造模，发现DFP+LPS组小鼠肺组织损伤情况较LPS组显著减轻，同时DFP预治疗后Nrf2、FTH1和GPX4蛋白的表达显著升高（均P < 0.05），见图 4。与4-OI发挥出相同的抑制铁死亡作用，进一步证明4-OI通过抑制LPS诱导的铁死亡来减轻肺损伤。
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| A：各组小鼠肺组织FTH1免疫荧光染色（×200）；B~C：Western印迹检测肺组织Nrf2，FTH1和GPX4蛋白表达及相对表达水平统计结果；D~E：RT-PCR检测Nrf2、FTH1和GPX4 mRNA相对表达水平；与对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.05 图 3 4-OI对铁死亡相关蛋白的影响 Fig 3 The effect of 4-OI on ferroptosis-associated proteins |
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| A：各组小鼠肺组织HE染色（×400）；B~C：Western印迹检测肺组织Nrf2、FTH1和GPX4蛋白表达及相对表达水平统计结果；与对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.05 图 4 4-OI及DFP对肺组织铁死亡相关蛋白的影响 Fig 4 The effect of 4-OI and DFP on ferroptosis-associated proteins. |
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ALI是由不可控的肺部及全身炎症反应对肺组织造成的直接或间接的损伤，多种经典的细胞死亡方式均被发现在LPS诱导的肺损伤中发挥重要作用，如焦亡，凋亡等[14-15]。铁死亡是一种由铁依赖的脂类过氧化调控的细胞死亡形式，不同于细胞凋亡、自噬或其他形式的细胞死亡[16]。细胞内游离铁的积累，脂质过氧化以及过氧化清除系统是调控铁死亡的最重要因素[2]。铁死亡已经被证明在缺血-再灌注损伤、神经退行性疾病和肿瘤等疾病中扮演重要角色。近年的研究表明在脓毒血症引起的急性心脏、肺、肾、肝脏等多器官损伤中铁死亡同样发挥了重要作用[17–20]。
Nrf2是细胞抗氧化反应的关键调节因子，控制诸多抗氧化和亲电应激的基因的表达[9]。除此之外，Nrf2也是重要的抗铁死亡转录因子。有研究表明，Nrf2通过上调STAT3增加谷氨酸胱氨酸转运体的最重要亚基溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）的表达，减轻急性肺缺血-再灌注损伤[21]。Nrf2也可以通过直接调控SLC7A11的转录上调，增加神经胶质母细胞瘤对于铁死亡的抵抗[22]。在非小细胞肺癌中，Nrf2通过上调GPX4抗铁死亡，导致癌细胞对于靶向药物产生耐药抵抗[23]。Nrf2还通过介导铁代谢相关基因，调控细胞内游离铁的积累进而调控铁死亡。既往研究发现，Nrf2激动剂通过激活Nrf2上调巨噬细胞膜铁转运蛋白（ferroportin, FPN），增加胞内铁外流，减少胞内游离铁的积累[24]。在一项针对乳腺癌细胞的转录组学与蛋白组学研究中，发现FTH1基因调节区具有抗氧化反应原件（antioxidant response element, ARE），受到Nrf2转录调控[25]，将胞内的游离铁转化为更稳定的结合铁形式，减少胞内游离铁的积累。
本研究发现在LPS诱导的ALI中，Nrf2表达显著降低，Nrf2靶基因GPX4、FTH1蛋白及mRNA水平受转录调控影响也显著降低，铁死亡明显增加。研究表明4-OI可以通过烷基化修饰Kelch样ECH相关蛋白（kelch like ECH associated protein 1, Keap1）的多个半胱氨酸残基，抑制Keap1/Nrf2复合物的形成及泛素化降解[8]。既往研究证明4-OI可以通过调控Nrf2减轻LPS诱导的ALI中的氧化应激和炎症，发挥对肺损伤的保护作用[26]。本研究也证实衣康酸衍生物4-OI与铁螯合剂DFP通过增加Nrf2水平，抑制铁死亡，显著改善LPS诱导的ALI。对机制的进一步探索发现4-OI逆转了LPS诱导的Nrf2的减少及靶基因转录抑制，显著增加了FTH1和GPX4的蛋白及mRNA水平，进而减少游离铁和脂质过氧化物的积累，发挥抗铁死亡作用。
本研究也存在部分局限性，4-OI在肺泡上皮细胞能否发挥抗铁死亡作用尚不明确，尚未通过敲低或过表达方式对4-OI调控Nrf2进行进一步验证。此外，内源性衣康酸与外源性合成的衣康酸衍生物是否存在作用靶点及调控机制上的差异仍需进一步探索。
综上所述，4-OI通过增加Nrf2上调GPX4及FTH1发挥抗铁死亡作用，减轻LPS诱导的ALI，为ALI的防治提供了新的治疗靶点及策略。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 何如愿：设计实验、实施实验、分析/解释数据、起草文章；刘博昊：实施实验、分析/解释数据；付庭吕：实施实验、技术支持；李宁、耿庆：指导实验设计、对文章的知识性内容作批评性审阅、经费支持
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