2022, Vol. 31
2. 河南师范大学生命科学院，新乡 453007;
3. 河南省胸科医院科研外事科，郑州 450008;
4. 武汉市汉口医院内三科，武汉 430012
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）为原因不明的间质性肺炎，在组织学和放射学上表现为普通型间质性肺炎（usually interstitial pneumonia，UIP）。IPF患者从诊断开始中位生存期仅2~3年，个体生存期差异很大，可病情缓慢进展存活多年，也可发生急性加重导致肺功能急速恶化，称为IPF急性加重(acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis, AE-IPF)。急性加重可以发生在IPF病程的任何阶段，是IPF患者死亡的重要原因[1]。本研究通过检测特发性肺纤维化患者血浆中的表面活性蛋白A（surfactant protein A, SP-A）、表面活性蛋白D（surfactant protein D, SP-D）、血浆微小RNA29b-3p（miR29b-3p）、miR30c-5p、外泌体miR21-5p和游离线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）表达水平变化，探索与AE-IPF有关的因素。
1 资料与方法 1.1 一般资料选择2014年5月至2019年10月在河南省胸科医院就诊或住院治疗的特发性肺纤维化患者，病情稳定者纳入IPF组，急性加重者纳入AE-IPF组。IPF组患者纳入标准：(1)排除其他已知病因的间质性肺疾病（如家庭和职业环境暴露、结缔组织疾病和药物）；(2)高分辨率CT（high-resolution CT, HRCT）呈现UIP型表现。排除合并其他肺病者，如支气管扩张症、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、肺部肿瘤等。AE-IPF组入选标准[1]：(1)既往或当前诊断IPF；(2)通常在1个月内发生的呼吸困难急性恶化或进展；(3)胸部HRCT表现为在原来网状阴影或蜂窝影等UIP型表现背景上，新出现双肺弥漫性磨玻璃影和(或)实变影。AE-IPF组排除心力衰竭或液体负荷过重患者。本研究经河南省胸科医院医学伦理学委员会批准并经患者知情同意，伦理审批号：2014（005）。
1.2 资料收集收集患者的一般情况，包括年龄、性别、职业史、环境接触史、吸烟史、基础疾病史、既往使用药物史。每一名患者都进行广谱的自身抗体筛查、血常规、肝肾功能、血脂、空腹血糖、抗“O”抗体（ASO）等检查。记录IPF组和IPAF组患者本次及既往就诊的HRCT，由两位放射科医生确定间质性肺疾病的类型。基础疾病史见表 1。
| 指标 | IPF组（n=28） | AE-IPF组（n=17） | F/χ2 | P值 |
年龄（岁， ） |
63.0±8.5 | 63.3±7.4 | 0.011 | 0.918 |
| 性别（男/女） | 23/5 | 14/3 | 0.000 | 1.000 |
| 高血压（例） | 5 | 4 | 0.213 | 0.711 |
| 冠心病（例） | 7 | 3 | 0.331 | 0.719 |
| 糖尿病（例） | 6 | 4 | 0.027 | 1.000 |
| 陈旧性脑梗塞（例） | 3 | 1 | 1.840 | 0.290 |
于清晨空腹由护士抽取外周静脉血5 mL，用EDTA抗凝，4 ℃保存30 min后送实验室进行血浆分离：1 000 g离心10 min，分离血浆和细胞组分。将采集好的血浆转移至单独的冻存管，置入-80 ℃冰箱保存。
采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者血浆天冬氨酸蛋白酶A(novel aspartie proteinase A, Napsin A)、SP-A和SP-D，分别设置标准品孔、待测样本孔。绘制标准曲线，根据样品OD值在该曲线图上查出相应检测指标含量，再乘上稀释倍数，即样本的实际浓度。
采用Ribo™ exosome isolation reagent提取外泌体；Trizol裂解外泌体，并提取RNA；利用紫外分光光度计K5500进行浓度和OD值的测定；采用Bulge-Loop™ miRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒说明书反转录合成miR21-5p cDNA。
实时荧光定量PCR法检测血浆miR-29b-3p、miR-30c-5p和外泌体miR29b-3p：采用MagZol Reagent提取血浆中总RNA，用SYBR Green Mix进行qRT-PCR检测，以cel-miR-39-3p为外参考，各设置3个复孔。PCR反应条件：启动阶段1个循环（95 ℃ 10 min），扩增阶段40个循环（95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s）。制作熔解曲线，采用相对定量法（2-ΔΔCt）计算。
游离线粒体DNA检测步骤简述如下：引物筛选；线粒体检测标准品制备；使用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒（QIAGEN）进行血清样品DNA提取；血清样品DNA-qPCR。血清DNA样品均稀释10倍。PCR总反应体系为10 μL，包括RNase-free H2O 2.2 μL，上、下游引物各0.4 μL，SYBR Green Mix 5 μL，模板DNA 2 μL。
1.4 统计学方法所有资料均采用SPSS 21.0统计软件进行分析处理。对计量资料进行正态性检验，符合正态分布的统计描述采用均数±标准差（
本研究共纳入45例特发性肺纤维化患者，其中男性37例，女性8例，年龄（63.1±8.5）岁。两组研究对象的一般资料差异无统计学意义（均P>0.05）。
2.2 两组间蛋白、miRNA和mtDNA表达水平比较IPF组与AE-IPF组两组间仅mtDNA表达水平差异有统计学意义（P<0.01），其余指标表达水平均差异无统计学意义（均P>0.05），见表 2。
| 分组 | Napsin A(ng/mL) | SP-A (pg/mL) | SP-D (pg/mL) | miR21-5p (copies/μL) | miR29b-3p (copies/μL) | miR30c-5p (copies/μL) | mtDNA (copies/μL) |
| IPF组（n=28） | 413.80 (197.59, 634.20) | 7198.53 (5184.44, 8811.64) | 76400.20 (8679.95, 103208.68) | 7.66 (3.62, 9.06) | 0.62 (0.30, 0.80) | 1.26 (0.44, 1.81) | 6404.22 (2671.50, 9386.00) |
| AE-IPF组（n=17） | 550.03 (233.65, 786.97) | 9045.43 (5690.34, 9415.08) | 82659.45 (12331.55, 142337.90) | 7.17 (3.33, 10.31) | 0.75 (0.29, 0.91) | 1.49 (0.70, 1.62) | 10143.48 (8045.85, 12609.65) |
| Z值 | 1.346 | 0.281 | 0.538 | 0.094 | 0.422 | 0.866 | 3.025 |
| P值 | 0.178 | 0.779 | 0.590 | 0.925 | 0.673 | 0.386 | 0.002 |
AE-IPF组ASO水平、低密度脂蛋白和载脂蛋白B较IPF组高，差异有统计学意义（均P<0.05）。其余指标两组间比较差异均无统计学意义（均P>0.05），见表 3、表 4。
| 分组 | 白细胞总数(×109/L) | 中性粒细胞比率（%） | 淋巴细胞比率（%） | 红细胞(×1012/L) | 血小板(×109/L) | ASO（IU/mL） |
| IPF组（n=28） | 8.45±3.43 | 60.89±18.49 | 25.19±13.05 | 4.38±0.71 | 228.57±50.83 | 32.38±19.91 |
| AE-IPF组（n=17） | 8.86±2.43 | 67.55±12.45 | 23.46±9.76 | 4.43±0.44 | 243.75±101.64 | 88.04±52.25 |
| F值 | 0.180 | 1.642 | 0.214 | 0.055 | 0.438 | 13.765 |
| P值 | 0.673 | 0.207 | 0.646 | 0.816 | 0.511 | 0.001 |
| 分组 | 空腹血糖（mmol/L） | 谷丙转氨酶（IU/L） | 尿素（mmol/L） | 肌酐（μmol/L） | 高密度脂蛋白（mmol/L） | 低密度脂蛋白（mmol/L） | 甘油三酯（mmol/L） | 载脂蛋白B(g/L) |
| IPF组（n=28） | 4.36±2.92 | 20.54±10.64 | 5.01±2.02 | 57.26±10.71 | 1.14±0.40 | 2.25±0.64 | 0.90±0.40 | 0.74±0.18 |
| AE-IPF组（n=17） | 4.47±4.25 | 21.05±16.00 | 5.41±1.88 | 64.43±14.68 | 1.09±0.22 | 3.13±0.85 | 1.07±0.44 | 1.04±0.23 |
| F值 | 0.011 | 0.015 | 0.413 | 3.405 | 0.069 | 5.669 | 0.622 | 9.021 |
| P值 | 0.916 | 0.903 | 0.524 | 0.072 | 0.796 | 0.030 | 0.428 | 0.008 |
采用逐步回归分析将mtDNA、ASO、肌酐和载脂蛋白B纳入模型为自变量，是否为AE-IPF作为因变量。逐步回归过程提示载脂蛋白B最终未纳入模型，分析结果显示ASO是发生AE-IPF独立预测因子（OR=1.068，95%CI：1.007~1.131，P<0.05）。见表 5。
| 因素 | β值 | S.E.值 | Wald值 | OR值 | 95%CI | P值 |
| ASO | 0.065 | 0.030 | 4.848 | 1.068 | 1.007~1.131 | 0.028 |
| mtDNA | 0.000 | 0.000 | 1.390 | 1.000 | 1.000~1.000 | 0.238 |
| 肌酐 | 0.012 | 0.073 | 0.028 | 1.012 | 0.877~1.169 | 0.868 |
mtDNA和ASO联合预测的效果优于ASO单指标预测，mtDNA和ASO联合的曲线下面积为0.884（95%CI：0.722~1.000，P<0.05）。结果见图 1、表 6。
|
| 图 1 预测指标的ROC曲线 |
|
|
| 变量 | 曲线下面积 | P值 | 95%CI | 敏感度 | 特异度 |
| ASO | 0.875 | 0.004 | 0.717~1.000 | 87.5% | 80.0% |
| mtDNA和ASO | 0.884 | 0.003 | 0.722~1.000 | 87.5% | 85.7% |
AE-IPF患者病情危重，进展迅速，预后差。近年来国际上对AE-IPF的定义及诊断标准不断更新，新的AE-IPF定义和诊断标准不再强调原因不明和排除感染。AE-IPF的危险因素和病因尚未完全明确，可能由自身内部免疫异常等因素导致原有疾病恶化，或因外部因素触发，或者两者同时存在，相互作用[2]。既往研究发现与AE-IPF有关的因素包括较低的用力肺活量和一氧化碳弥散量[3]；外源性因素，包括感染、空气污染、误吸或侵入性操作都可能是导致AE-IPF的诱因[4]。
Bueno等[5]发现在IPF、过敏性肺炎和自身免疫性间质性肺疾病的血浆mtDNA水平显著升高，而IPF患者的支气管肺泡灌洗液中mtDNA升高更为显著，且仅在IPF患者中发现血浆mtDNA水平与疾病严重程度之间显著相关。肺泡Ⅱ型上皮细胞中PTEN诱导激酶1缺陷导致线粒体稳态缺陷引起氧化损伤和mtDNA释放，释放的mtDNA被TOLL样受体9识别，诱导下游TGF-β介导的促纤维化反应。Sakamoto等[6]对70例IPF患者血清mtDNA浓度进行测定，通过ROC曲线分析发现血清mtDNA浓度为1 371.5 copies/μL可以对一年内发生AE-IPF风险的受试者进行分层。如果以1年内%FVC下降10%、急性加重或一年内死亡作为综合性的不良预后指标，血清mtDNA水平比其他常见的IPF生物标志物（如KL-6、SP-D）具有更好地预测效果。研究中7名受试者在诊断后3个月内死于急性加重，其血清mtDNA浓度相对于个人的基线浓度显著增加，而KL-6和SP-D的血清浓度在这些受试者中仅表现出适度的变化。以上既往研究结果表明稳定IPF患者的血清mtDNA水平可以预测未来的疾病变化。
本研究中IPF急性加重时血浆mtDNA的拷贝数较IPF稳定时明显升高，联合ASO判断AE-IPF的敏感度和特异度分别达87.5%和85.7%。在IPF患者中，肺细菌负荷可预测纤维化进展，微生物群多样性和组成与肺泡促纤维化细胞因子的增加相关。在小鼠纤维化模型中，肺生态失调先于肺损伤高峰并且持续存在[7]。Han等[8]发现IPF的进展与肺泡灌洗液中的葡萄球菌和链球菌属存在有关，但未明确是否存在因果关系。O'Dwyer等[9]发现肺泡灌洗液中细胞因子在健康对照受试者和IPF患者存在差异有统计学意义；肺细菌多样性的减少与促炎性因子、促纤维化细胞因子和生长因子的肺泡浓度增加显著相关，包括IL-1Ra、IL-1β、CXCL8、MIP-1a、G-CSF、VEGF和表皮生长因子等。与健康志愿者相比，IPF肺泡灌洗液IL-1Ra的浓度显著增加，IL-15和IL-7浓度降低。表皮生长因子与毛螺菌科的存在相关，IL-15与毛螺菌科的存在呈负相关，IL-1RA阳性与韦荣球菌属的存在呈正相关，IL-1β与乳杆菌科和普氏菌的存在呈正相关[9]。本研究显示AE-IPF时出现ASO明显升高，结合上述文献，考虑与AE-IPF时肺内链球菌载量升高有关，ASO可能是反映IPF链球菌载量的临床指标。
目前发现脂质代谢与IPF发病存在一定关系。Reyfman等[10]检测到500多个在IPF患者中异常表达的基因，在肺泡Ⅱ型上皮细胞中，IPF下调的前500个基因均涉及脂质代谢途径，包括甾醇/类固醇生物合成过程、胆固醇代谢过程和脂质代谢过程。肺泡巨噬细胞也表现出明显的脂质代谢的改变，包括对脂肪酸的细胞反应和脂质代谢过程调控。博来霉素诱导的纤维化导致肺组织脂肪合成基因mRNA减少的变化。肺泡Ⅱ型上皮细胞内脂质，包括胆固醇、游离FA、甘油三酯、PL减少以及ABCA3 mRNA表达降低，而在肺泡灌洗液中是增加的[11]。研究发现载脂蛋白或脂蛋白受体与IPF有关，如IPF组血清淀粉样蛋白A较健康对照组升高，与FVC预计值%和高密度脂蛋白呈负相关[12]。本研究显示低密度脂蛋白和载脂蛋白B在特发性肺纤维化急性加重时升高，可能提示脂质代谢在IPF中有一定的作用。
IPF中的生物标志物领域是一个新兴领域，目前已发现很多分子在IPF中有明显改变，如SP-A、SP-D、KL-6和miRNA等可考虑作为生物标志物[13]，但它们与IPF急性加重的关系尚不确定。本研究对Napsin A、SP-A、SP-D、miR21-5p、miR29b-3p、miR30c-5p在AE-IPF中的表达进行研究，并未发现它们与IPF急性加重存在明显相关。
在症状加重之前，早期预测AE-IPF的发生，就有可能预防急性加重或者缩短急性加重病程，预防性地使用药物，以改善患者预后。本研究发现AE-IPF患者血浆低密度脂蛋白、载脂蛋白B、游离mtDNA和ASO水平均较IPF稳定患者升高，血浆游离mtDNA联合ASO水平可在一定程度上预测AE-IPF的发生，但尚不清楚以上指标在急性加重中的机制，仍需要进一步临床研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 李飞：研究设计、统计学分析、论文撰写、实施研究；朱明慧、王晓博、李惠：实施研究、数据收集及整理；于洪涛、余国营：研究设计；周东鹏：论文指导、研究经费支持
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