中华急诊医学杂志  2021, Vol. 30 Issue (11): 1329-1333   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2021.11.009
氢吗啡酮后处理经PI3K/Akt通路减轻大鼠心肌缺血-再灌注细胞凋亡
王赟 , 张宗泽 , 张婧婧 , 吴云 , 王焱林     
武汉大学中南医院麻醉科 430071
摘要: 目的 探讨PI3K/Akt信号通路在氢吗啡酮后处理减轻大鼠心肌缺血-再灌注细胞凋亡中的作用。方法 健康雄性SD大鼠40只,按照随机数表法随机分为5组,每组8只,假手术组(Sham组)、缺血-再灌注组(I/R组)、缺血-再灌注+氢吗啡酮组(I/R+H组)、缺血-再灌注+PI3K抑制剂组(I/R+W组)、缺血-再灌注+氢吗啡酮+ PI3K抑制剂组(I/R+ H+ W组)。采用左冠状动脉前降支结扎30 min、再灌注120 min的方法建立心肌缺血-再灌注损伤模型。实验结束后,用TTC染色法测心肌梗死面积;用比色法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;末端标记法(TUNEL)测心肌细胞凋亡;Western blot法检测p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达。采用SPSS 13.0软件行统计分析。采用单因素方差分析进行组间比较。结果 与Sham组比较,I/R组心肌梗死面积、血清LDH漏出量及心肌细胞凋亡增多,p-Akt表达和Bax表达上调,Bcl-2表达下调(P < 0.05);与I/R组比较,I/R+H组心肌梗死面积、血清LDH漏出量及心肌细胞凋亡减少,心肌p-Akt及Bcl-2表达上调,Bax表达下调(P < 0.05);与I/R+H组比较,I/R+H+W组心肌梗死面积、血清LDH漏出量及心肌细胞凋亡增多,p-Akt表达和Bcl-2表达下调,Bax表达上调(P < 0.05)。结论 氢吗啡酮后处理可减轻心肌缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡,其心肌保护机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。
关键词: 缺血-再灌注    凋亡    氢吗啡酮    磷脂酰肌醇-3-激酶    蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶    
Hydromorphone postconditioning attenuates myocardial ischemia/reperfusion-induced apoptosis in rats through PI3K/AKT pathway
Wang Yun , Zhang Zongze , Zhang Jingjing , Wu Yun , Wang Yanlin     
Department of Anesthesiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China
Abstract: Objective To investigate the role of PI3K/Akt signaling pathway in hydromorphone postconditioning on alleviating myocardial ischemia/reperfusion (I/R)-induced apoptosis in rats. Methods Forty healthy male SD rats were randomly(random number) divided into five groups, with 8 rats in each group: ①sham group; ②I/R group; ③I/R+hydromorphone group (I/R+H group); ④I/R+PI3K inhibitor group (I/R+W group); and⑤I/R+hydromorphone+PI3K inhibitor group (I/R+H+W group). The myocardial ischemia/reperfusion injury model was established by ligating the left anterior descending coronary artery for 30 min and reperfusion for 120 min. After the experiment, the area of myocardial infarction was measured by 2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) staining. The amount of serum lactate dehydrogenase (LDH) leakage was estimated by colorimetry. The cardiomyocyte apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay. The protein expressions of p-Akt, Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. Comparisons among groups were carried out by analysis of variance (ANOVA). Results Compared with the sham group, the area of myocardial infarction, serum LDH leakage and cardiomyocyte apoptosis were significantly increased, p-Akt and Bax expression were upregulated, Bcl-2 expression was downregulated in the I/R group (P < 0.05). Compared with the I/R group, the area of myocardial infarction, serum LDH leakage and cardiomyocyte apoptosis were markedly decreased, p-Akt and Bcl-2 expression were upregulated and Bax expression was downregulated in the I/R+H group (P < 0.05). Compared with the I/R+H group, the area of myocardial infarction, serum LDH leakage and cardiomyocyte apoptosis were significantly increased, p-Akt and Bcl-2 expression were downregulated, and Bax expression was upregulated in the I/R+H+W group (P < 0.05). Conclusions Hydromorphone postconditioning can alleviate cardiomyocyte apoptosis induced by myocardial ischemia/reperfusion, and its protection mechanism may be related to the activation of PI3K/Akt signaling pathway.
Key words: Ischemia/reperfusion    Apoptosis    Hydromorhphone    Phosphatidylinositol-3-kinase    Protein serine threonine kinase    

缺血后处理是指在心肌发生缺血后,在再灌注之前对缺血心脏进行多次短暂的缺血-再灌注,以减轻心肌损伤的方法[1]。一些经典的阿片类药物(如吗啡)后处理也具有相似的心肌保护作用[2-3]。氢吗啡酮是一种新型的μ-阿片受体激动剂,其镇痛效果比吗啡高5倍,已被证实具有较好的心肌保护作用[4-6]。在再灌注初期给予适量的氢吗啡酮可减轻离体心肌缺血再灌注损伤[5-6],而氢吗啡酮后处理对在体心肌缺血-再灌注损伤的影响及机制尚不清楚。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(serine/threonine kinase, Akt)是细胞内最重要的信号转导途径,在调节细胞凋亡、增殖及存活方面发挥着重要生物学功能[7]。研究表明,PI3K/Akt信号通路的激活在心肌再灌注损伤的保护中起着决定性作用。缺血后处理及多种阿片类药物后处理均可通过激活PI3K/Akt信号途径,减轻心肌细胞凋亡,发挥心肌保护作用[2-3, 8]。因此,本研究拟评价PI3K/Akt信号通路在氢吗啡酮后处理减轻心肌缺血-再灌注细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康雄性40只Sprague Dawley(SD)大鼠,SPF级,体质量220~250 g,由武汉大学中南医院动物中心提供。动物合格证号:SCXK(鄂)2008-0004。饲养于独立的通风笼系统中,每笼5只。温度(22 ± 2) ℃,湿度(48±5) %,每天光照与黑夜时间各12 h。在实验过程中,建模和取材的操作均在超洁净工作台中进行,专人负责添加饲料,换水和给药。所有动物和实验程序均符合国家卫生研究院《实验动物护理和使用指导原则》(NIH出版物第80-23号),并经武汉大学动物伦理委员会批准。

1.2 主要药物和试剂

盐酸氢吗啡酮注射液(批号H20120100)购自湖北宜昌人福药业有限责任公司;渥曼青霉素、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2, 3, 5 - Triphenyltetrazole chloride,TTC)购自美国Sigma公司;末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(terminal-deoxynucleoitidyltransferase mediatednick end labeling,TUNEL) 检测试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自美国Roche公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;戊巴比妥钠由上海新亚药业有限公司提供;BCA蛋白测定试剂盒购自碧云天生购自物技术研究所;Bcl-2、Bax、phosphorylated Akt(p-Akt)、GAPDH一抗均购自美国Santa Cruz公司。

1.3 主要仪器

DW-2000型小型动物呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司);小动物手术器械(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);HH-501超级恒温水槽(江苏金坛市成辉仪器厂);SHINESO MF1高速冷冻离心机(美国Beckman公司);MR23i高速多功能冷冻离心机、DU530分光光度计(美国Thermo公司);MDF-U442低温保持箱(日本三洋公司);TS-200B恒温摇床(上海天呈实验仪器制造有限公司)。

1.4 模型制备

按参考文献[2]的方法建立心肌缺血-再灌注损伤模型,大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后,行气管切开,接微型呼吸机机械通气(呼吸频率60次/min,潮气量20 mL/kg)。沿胸骨左缘第四肋骨开胸,结扎左冠状动脉前降支,结扎30 min后松开结扎线,再灌注120 min。以结扎后左心室前壁结扎下心肌颜色发绀和运动功能下降,心电图ST段明显抬高和(或)T波高耸作为冠状动脉结扎成功的标准,放松丝线则先前缺血心肌颜色立刻恢复正常,抬高的ST段回落1/2以上标志冠状动脉恢复血液灌注。

1.5 分组及给药

40只健康雄性SD大鼠随机(随机数字法)分为5组:①假手术组(Sham组,n=8),打开胸腔,左冠状动脉前降支只穿线不结扎;②缺血-再灌注组(I/R组,n=8),结扎左冠状动脉前降支30 min后再灌注2 h;③缺血-再灌注+氢吗啡酮组(I/R+H组,n=8),再灌注前5 min经股静脉注入氢吗啡酮0.1 mg/kg,其余同I/R组;④缺血-再灌注+PI3K抑制剂组(I/R+W组,n=8),再灌注前5 min经股静脉注入渥曼青霉素15μg/kg,其余同I/R组;⑤缺血-再灌注+氢吗啡酮+PI3K抑制剂组(I/R+H+W组,n=8),于再灌注前5 min经股静脉注入氢吗啡酮0.1 mg/kg及渥曼青霉素15 μg/kg,其余同I/R组。氢吗啡酮、渥曼青霉素的给药剂量参照文献报道[6]及预实验来确定。

1.6 心肌梗死面积的测定

再灌注结束时将左冠状动脉前降支重新结扎,经股静脉注射0.5%伊文蓝1.5 mL, 待缺血区显示后迅速取出心脏,用冰冻生理盐水冲洗后剪除心房,-20℃冰冻10 min, 沿左室长轴切成1.0 mm厚的薄片,置于1% TTC溶液中,37℃孵育20 min后,用4%多聚甲醛溶液固定,观察染色结果,非梗死心肌组织为红色,梗死心肌为苍白色。分离各染色区分别进行称重,缺血面积(area at risk,AAR)=危险区心肌重量/左室总重量×100%。梗死面积(infarct size,IS)=梗死区心肌重量/危险区心肌重量×100%。

1.7 血清乳酸脱氢酶(LDH)活性检测

再灌注2 h后,经腹主动脉采血,按照LDH试剂盒说明书用RT-6000生化自动分析仪(Rayto公司,美国)测定LDH活性。

1.8 Western blot检测p-Akt(Ser473)、Bcl-2、Bax蛋白表达

再灌注结束时,随机取6只大鼠,处死后剪取缺血心尖心肌组织,生理盐水冲洗血液。将心尖缺血心肌组织剪碎,加入裂解液,13 000 g离心30 min,取上清,用BCA蛋白法定蛋白含量。取50 mg胞浆蛋进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜于PDVF膜上,5%脱脂牛奶封闭2 h。依次用的兔抗鼠p-Akt(1∶1 000)、兔抗鼠Bcl-2(1∶1 000)、兔抗鼠Bax(1∶1 000)和的GAPDH抗体(1∶10 000),4℃下孵育过夜。取膜用溶液漂洗3次后加入羊抗兔二抗(1∶10 000)摇床孵育2 h。TBST冲洗3次后,滴加新鲜配制的ECL混合溶液,暗室中曝光。采用并使用Image-J软件分析蛋白条带灰度,以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值反映心肌组织p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。

1.9 末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡

取左心室前壁部分组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,切片。按常规方法将石蜡切片进行脱蜡水合(二甲苯脱蜡2次,每次10 min,将脱蜡好的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇,每次2 min)。切片浸入PBS漂洗3次,每次5 min。吸干切片周围的水分后,将切片加入蛋白酶K工作液,37℃孵育30 min。PBS漂洗3次,每次5 min。在切片上滴加TUNEL检测液,37℃孵育1 h,荧光显微镜下观察拍照。随机选取5个高倍(×200)视野,光镜下分别计数凋亡细胞数和总细胞数,以凋亡细胞数占细胞总数的百分比作为凋亡指数(apoptotic index, AI),AI=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100,评价凋亡程度。

1.10 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用单因素方差分析,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 心肌梗死面积的比较

与Sham组相比,I/R组心肌梗死面积显著增加(P < 0.05);与I/R组相比,I/R+H组心肌梗死面积显著缩小(P < 0.05);与I/R+H组相比,I/R+H+W组心肌梗死面积显著增大(P < 0.05)。而I/R+W组与I/R组相比心肌梗死面积差异无统计学意义(图 1A)。

与Sham组比较,aP < 0.05;与I/R组比较,bP < 0.05;与I/R+H组比较,cP < 0.05 图 1 五组大鼠心肌梗死面积、血清LDH活性的比较(n=8) Fig 1 Comparison of the area of myocardial infarction and serum LDH leakage among the five groups (n=8)
2.2 血清LDH活性比较

与Sham组相比,I/R组血清LDH活性明显增高(P < 0.05);与I/R组相比,I/R+H组血清LDH活性显著降低(P < 0.05);与I/R+H组相比,H/R+H+W组组血清LDH活性显著升高(P < 0.05)。而I/R+W组与I/R组相比血清LDH活性差异无统计学意义(图 1B)。

2.3 心肌组织p-Akt(Ser473)、Bcl-2、Bax蛋白的表达

与Sham组比较,I/R组p-Akt表达和Bax表达上调,Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax降低(P < 0.05);与I/R组比较,I/R+H组p-Akt及Bcl-2表达上调,Bax表达下调,Bcl-2/Bax升高(P < 0.05);与I/R+H组比较,I/R+H+W组p-Akt表达和Bax表达上调,Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax降低(P < 0.05);而I/R+W组与I/R组相比p-Akt、Bcl-2、Bax表达差异无统计学意义(图 2)。

与Sham组比较,aP < 0.05;与I/R组比较,bP < 0.05;与I/R+H组比较,cP < 0.05 图 2 五组大鼠心肌p-Akt(Ser473)、Bcl-2、Bax蛋白表达比较(n=8) Fig 2 Comparison of p-Akt (Ser473), Bcl-2 and Bax protein expression in myocardium tissues among the five groups (n=8)
2.4 心肌细胞凋亡的比较

与组相比,I/R组心肌细胞凋亡指数显著增高(P < 0.05);与I/R组相比,I/R+H组心肌细胞凋亡指数显著降低(P < 0.05);与I/R+H组比较,I/R+H+W组心肌细胞凋亡指数显著增高(P < 0.05)。而I/R+W组与I/R组相比心肌细胞凋亡差异无统计学意义(图 3)。

与Sham组比较,aP < 0.05;与I/R组比较,bP < 0.05;与I/R+H组比较,cP < 0.05 图 3 五组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较(×200,n=8) Fig 3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis index among the five groups (original magnification×200, n=8)
3 讨论

心肌缺血-再灌注损伤是临床常见的病理生理现象。大鼠因其冠状动脉侧枝少,来源广、价格低廉而成为复制心肌缺血-再灌注损伤常用的实验动物。心肌梗死面积是评价心肌损伤严重程度的最直接指标。本研究参照文献[2]中的方法建立心肌缺血-再灌注损伤模型,结果表明,与Sham组比较,I/R组心肌梗死面积增加。心肌酶是反映心肌损伤的血清标准,LDH是常见心肌损伤酶。与Sham组相比,缺血-再灌注组血清LDH的释放明显增多。这些结果提示大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型制备成功。

细胞凋亡是心肌缺血-再灌注损伤发病机制中的重要环节之一。心肌细胞凋亡程度决定心肌梗死和心功能障碍程度,而抑制细胞凋亡可明显减轻心肌缺血-再灌注损伤[9]。氢吗啡酮是一种新型μ-阿片受体激动剂,具有起效快、镇痛作用强、不良反应少等优点。既往对氢吗啡酮心肌保护方面的研究表明,氢吗啡酮后处理有助于维持离体心肌缺血-再灌注时的电生理稳定性,抑制心律失常的发生,改善左室功能,其心肌保护机制与抑制再灌注初期线粒体膜转运孔开放有关[5-6]。本研究参照文献[6]及预实验结果选择氢吗啡酮的给药剂量,本研究结果表明,与I/R组比较,I/R+H组心肌梗死面积和心肌细胞凋亡降低,I/R+W组上述指标无差异,提示氢吗啡酮后处理可减轻大鼠心肌缺血-再灌注损伤和凋亡,与上述文献报道一致。

Bcl-2蛋白家族促凋亡蛋白(Bax、Bid和Bak)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)之间的平衡在启动内源性凋亡通路中起着重要的作用。Bcl-2/Bax比值增高促进细胞存活,Bcl-2/Bax比值降低促进细胞凋亡[9-10]。既往研究表明,阿片类药物后处理可通过调节Bcl-2、Bax蛋白表达发挥抗凋亡作用[3]。在本实验中,缺血-再灌注后,Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增多,Bcl-2/Bax比率降低,而氢吗啡酮后处理可增加Bcl-2表达,抑制Bax表达,提高Bcl-2/Bax比率,更一步提示氢吗啡酮后处理可减缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡。

PI3K是细胞内重要的信号转导分子,PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化生成生成3, 4二磷酸磷脂酰肌醇(PI3, 4P2)、3, 4, 5-三磷脂酰肌醇(PI3, 4, 5P3),它们均可作为第二信使在细胞中传递并介导PI3K的多种细胞功能[7, 11]。Chiari等[12]在兔在体心肌缺血-再灌注实验模型上发现,给予PI3K抑制剂渥曼青霉素后,缺血后处理和异氟烷后处理的心肌保护作用均丧失。Weihrauch等[13]研究发现,吗啡可以通过激活PI3K/Akt信号通路促进异氟烷后处理的抗心肌细胞凋亡作用。Wu等[3]在大鼠心肌缺血/再灌模型中也发现,在再灌注初期应用舒芬太尼可减轻心肌损伤抑制心肌细胞凋亡,而给予渥曼青霉素后,舒芬太尼后处理的心肌保护作用均明显减弱。提示缺血后处理和阿片类药后处理均可通过激活PI3K信号途径发挥保护作用。据报道,活化的PI3K可通过诱导Akt的磷酸化而发挥作用。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它是PI3K最主要的靶酶。当PI3K途径中当上游信号刺激细胞膜表面时,在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶的帮助下,PI3, 4P2和PI3, 4, 5P3可与Akt结合,导致Akt从胞浆转位到质膜,并促进Akt磷酸化,进而激活Akt[14-15]。Akt由N-末端PH结构域、中间区催化结构域、C-末端调节域三部分组成。位于调节域C末端的Ser473位点的磷酸化是使Akt达到完全激活的必要条件。激活的Akt主要通过Bad蛋白(Bcl-2蛋白家族成员之一)、caspase-3、糖原合成酶发挥广泛的生物学效应,包括抗凋亡,促细胞生存等[14-15]。本研究结果显示,与Sham组比较,I/R组p-Akt表达增高,提示机体内在自我保护机制被激活。而且给予氢吗啡酮处理后,心肌组织p-Akt活性进一步增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增高,促凋亡蛋白Bax表达减少,Bcl-2/Bax比值降低,心肌细胞凋亡减少,提示氢吗啡酮后处理抗凋亡作用与Akt激活有关。然而,预先加入PI3K/Akt特异性抑制剂后,氢吗啡酮后处理的保护作用明显受到抑制,提示氢吗啡酮后处理可通过激活PI3K/Akt信号通路发挥心肌保护作用。

综上所述,氢吗啡酮后处理可减轻心肌缺血-再灌注引起的心肌细胞凋进而减轻心肌损伤,其机制可能是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。

利益冲突   所有作者均声明不存在利益冲突

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