2021, Vol. 30
2. 徐州医科大学附属医院呼吸内科，徐州 221000
本实验所用病毒为小鼠巨细胞病毒Smith株。所用质粒分别以GP96基因和gB基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1重组构建而成，命名为pGP96和pgB。所用的动物为SPF级雌性BALB/C小鼠，6~8周龄。关于动物的操作符合动物实验伦理基本要求。
1.2 药物与试剂DNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，质粒提取试剂盒购自罗氏公司，阳离子多聚体聚乙烯亚胺（PEI）购自Sigma公司，MCMV IgA、IgG ELISA试剂盒购自珠海海泰生物公司。
1.3 免疫接种取32只小鼠随机（随机数字法）分4组：pcDNA3.1组、pGP96组、pgB组和pGP96+ PEI-pgB组。将gB和GP96两种质粒用PEI包裹后，分别在各组小鼠经鼻腔滴入相应的质粒50 μg，每2周一次。每次接种后隔周收集粪便，并从小鼠眼眶后静脉丛采血0.1 mL离心取血清。末次免疫2周后，经腹腔注射3LD50 MCMV培养上清液。称量各组小鼠腹腔注射前及注射7 d后的体质量。取40只小鼠随机随机数字法分4组同上操作，末次免疫两周后以致死剂量（5LD50）MCMV培养上清液经腹腔注射，逐日观察各组小鼠染毒后的存活情况，共观察28 d。
1.4 ELISA检测粪便IgA及血清IgG血液2 500 r/min，4℃离心10 min后收集上清液-80℃冻存；粪便以100 mg/mL浓度溶解于PBS溶液中，充分混旋后，2 500 r/min，4℃离心10 min后收集上清液-80℃冻存。ELISA法检测IgG、IgA浓度。
1.5 小鼠肠系膜淋巴结单细胞悬液CD8、IFN-γ、CD11c、CD80染色腹腔注射后7 d，制备各组小鼠去除红细胞的肠系膜淋巴结单细胞悬液。流式细胞术检测CD8、IFN-γ、CD11c、CD80的量。
1.6 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件处理，计量资料数以均数±标准差（Mean±SD）表示。数据采用单因素方差分析（One-Way-ANOVA）以及重复测量资料方差分析，率的比较采用非参数检验，检验水准α = 0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ELISA检测血清IgG、粪便IgA用ELISA法检测血清IgG和粪便IgA浓度。结果发现pgB组和pGP96+pgB组均显著高于pcDNA3.1组。此外pgB+pGP96免疫组比pgB组产生更高水平的IgA和IgG（表 1及图 1）。
| 组别 | pcDNA3.1 | pGP96 | pgB | pGP96+pgB |
| 血清IgG | ||||
| 0周 | 0.18±0.04 | 0.18±0.03 | 0.17±0.03 | 0.18±0.03 |
| 8周 | 0.16±0.03 | 0.19±0.04 | 0.72±0.08a | 0.96±0.03ab |
| 粪便IgA | ||||
| 0周 | 0.11±0.03 | 0.12±0.02 | 0.12±0.01 | 0.13±0.02 |
| 8周 | 0.12±0.03 | 0.14±0.02 | 0.59±0.05a | 0.81±0.07ab |
| 注：与pcDNA3.1组比较，a P＜0.05; pGP96+pgB组与pgB组比较，b P＜0.05 | ||||
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| A：小鼠血清IgG含量；B：小鼠粪便IgA含量。pgB组与pgB+pGP96组相比，aP＜0.05 图 1 小鼠滴鼻免疫后血清IgG和粪便IgGA的浓度 |
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腹腔注射7 d后，检测各组小鼠体质量，结果显示各组小鼠体质量均有所下降，但pGP96+pgB组小鼠比pgB组体质量下降幅度更小，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表 2、图 2）。
| 组别 | 染毒前 | 染毒后 |
| pcDNA3.1 | 25.4±1.21 | 20.9±0.72 |
| pGP96 | 25.7±1.67 | 21.3±0.74 |
| pgB | 25.7±1.13 | 22.7±0.57a |
| pGP96+pgB | 25.3±1.11 | 24.6±0.45ab |
| 与pcDNA3.1组比较，a P＜0.05; pGP96+pgB组与pgB组比较，b P＜0.05 | ||
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| 与pgB+pG96组相比，ap < 0.05 图 2 感染病毒7 d后各组小鼠体质量变化pgB组 |
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腹腔注射7 d后取各组小鼠肠系膜淋巴结制成单细胞悬液，用PE-cy7-anti-CD8与APC-IFN-γ抗体双染后用流式细胞术检测。结果显示：与pgB单免疫组相比，pGP96联合pgB共免疫在肠系膜处诱导分泌CD8+IFN-γ+T淋巴细胞数量显著增多（图 3）。
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| A: pcDNA3.1组, B: pGP96组, C: pgB组, D: pGP96+pgB组, E: 各组结果柱状图(n=8)。pgB组与pgB+pGP96组相比，aP＜0.05 图 3 各组分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞流式检测结果 |
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流式细胞术检测染毒7 d后各组小鼠肠系膜淋巴结单细胞悬液中DC的数量与成熟度变化。结果显示共免疫组的DC在肠系膜淋巴结中的比例显著升高，成熟细胞的比例也明显高于单免疫组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 4）。
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| A: pcDNA3.1组, B: pGP96组, C: pgB组, D: pGP96+pgB组, E: pcDNA3.1组, F: pGP96组, G: pgB组, H: pGP96+pgB组, I、J: 各组结果柱状图(n=8)。pgB组与pgB+pGP96组相比，aP＜0.05 图 4 各免疫组小鼠肠系膜淋巴结单细胞的DC的数量与成熟度 |
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以致死剂量MCMV腹腔注射小鼠，观察28 d内小鼠存活情况，结果显示共免疫组有80%的小鼠实现长期存活，存活率明显高于单免疫组及空载体组（图 5）。
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| 图 5 8 d内小鼠存活情况 |
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gB是病毒包膜中最丰富的蛋白质之一，对于病毒进入宿主细胞和细胞间传播十分重要[15-16]。所有CMV血清阳性个体的血清中都含有gB抗体，且恢复期血清中高达70%的中和抗体应答是gB特异性的，gB作为疫苗靶点具有良好研究意义。gB可诱导大部分的中和抗体，却不能诱导高水平CTL应答，因此无法有效清除已感染细胞，而要控制HCMV感染，细胞免疫非常重要。故本研究着力于探寻进一步提高gB核酸疫苗免疫效能的方法。
GP96被认为是一种免疫佐剂，在HBV、HIV或HPV疫苗研究中常作为有效的T细胞活化刺激组分[17-20]。Li等[21]发现gp96及其N-末端片段具有增强针对乙型肝炎病毒的CTL应答的能力。其发挥免疫效应既可以通过激活抗原呈递细胞，启动特异性细胞免疫应答；也可以通过激活NF-ΚB信号转导，启动非特异性细胞免疫应答[22]。DC在启动T淋巴细胞免疫应答中发挥中心和独特作用。病毒感染通常刺激DC成熟并产生有效的抗病毒T淋巴细胞反应[23]。CD8+ T淋巴细胞是控制HCMV感染的主要细胞类型。细胞毒性CD8+ T淋巴细胞的主要功能在于对病毒感染的靶细胞的特异性裂解，包括分泌IFN-γ等细胞因子，进而发挥抗病毒效应[24-25]。本研究制备了DNA疫苗的黏膜递送系统，然后将pgB联合pGP96共免疫小鼠，结果显示与gB单免疫相比，共免疫组血清IgG及粪便IgA水平显著增高，且共免疫组小鼠在肠系膜淋巴结处DC成熟度比例及IFN-γ+ CD8+ T淋巴细胞比例显著升高；在致死剂量的CMV感染下，共免疫组表现出更高的保护力度，提示GP96作为佐剂可能提高黏膜免疫保护作用并有效的促进全身抗体水平的增加，提供免疫保护作用。
致谢: 本研究所用pcDNA3.1-GP96、pcDNA3.1-gB质粒由徐州医科大学附属医院急诊科实验室郭秉楠研究员合成和提供，特此表示感谢。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。
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