中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)，是由中性粒细胞核内组分释放到细胞外形成的一种网状纤维结构。最初认为NETs是具有抗菌作用的介质，但近年来研究发现它也可发挥促炎和促凝作用，并引起内皮细胞损伤、血小板活化、微血管闭塞，最终导致组织灌注不良，从而参与多种疾病的进展^[1]。现就NETs在急危重症中的研究进展综述如下。

1 NETs的形成

NETs是由中性粒细胞释放出的组蛋白、DNA和蛋白酶组成^[2-4]，其中蛋白酶包括髓过氧物酶（MPO）、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、钙卫蛋白和α防御素等。虽然NETs中的DNA大部分来源于细胞核，但也有部分源于线粒体^[5-7]。另有研究表明，NETs的组分随刺激因素的不同而不同^[8]，例如在佛波酯（PMA）诱导的NETs中鉴定出24种蛋白，而铜绿假单胞菌非黏液型和黏液型菌株诱导产生的NETs有80种蛋白^[9]。然而，NETs构成的差异是否影响和如何影响其功能仍有待研究。

1.1 NETs的诱导剂

在对感染性疾病的研究中发现，来自细菌、真菌、病毒或寄生虫等病原体相关模式分子（PAMPs）可通过活化模式识别受体（PRRs）如Toll样受体（TLR）、补体受体等激活下游MAPK、PI3K/AKT等促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生，而ROS不仅可以调控肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylarginine deiminase 4, PAD4)催化组蛋白精氨酸残基瓜氨酸化，促进染色质去聚化，还可介导嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶从嗜天青颗粒中释放出来进入到核蛋白并水解组蛋白，进而破坏染色质的组装，最终使染色质吸附各种颗粒蛋白及酶形成NETs ^[10]。同样在非感染性疾病中发现炎症微环境中的一些损伤相关模式分子（DAMPs），发挥了类似于病原体相关模式分子的作用，同样通过模式识别受体相关信号级联诱导NETs的形成，例如肺肿瘤细胞来源的高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）、乳腺癌炎性微环境中的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、胰腺癌中的晚期糖基化终末产物（AGEs）等均可通过“与受体结合”，即通过与受体结合激活ROS信号级联，导致中性粒细胞形成NETs。另外，包括佛波酯、脂多糖（LPS）、IL-8和胆固醇晶体等也可直接诱导NETs的形成^{[7, 11]}。

1.2 NETs形成的过程

在体外刺激形成NETs时可导致中性粒细胞死亡，但体内的中性粒细胞受刺激后将细胞内物质释放到细胞外形成NETs后仍可能保持其活性和功能，表明NETs的形成不一定是一个终端事件。另外，NETs不包含中性粒细胞细胞质和膜成分，这区别于细胞坏死或凋亡后的DNA释放^[12]。虽然NETs形成的机制依赖于刺激的类型^[13]，但目前认为NETs的形成主要有两种途径：一种是作为细胞死亡的一种独特形式，其特征是向细胞外空间释放去聚化的染色质和颗粒物质；另一种是DNA及丝氨酸蛋白酶从完整的中性粒细胞中被挤出的机制^{[12, 14]}。这两种途径所引起的NETs相关病理过程的最基本区别在于刺激的本质和NETs释放的时机。

中性粒细胞形成NETs的过程被称为NETosis。NETs的被释放主要有两种方式：一种为自杀性NETosis（suicidal NETosis），这是一种独特的细胞死亡形式，中性粒细胞的分叶核结构消失，核膜和颗粒膜分解，染色质疏松化，核染色质进入细胞质与颗粒成分混合，然后细胞膜裂解，NETs被释放到细胞外^[9]，这一过程需要3~8 h，依赖于还原型辅酶II（NADPH）及ROS的产生，该途径可在佛波酯或IL-8等物质刺激中性粒细胞后观察到^[15]；另一种被称为Vital NETosis，从完整的中性粒细胞线粒体中分泌DNA/丝氨酸蛋白酶，这个过程与细胞死亡无关，以病原体相关分子模式的形式，被宿主模式识别受体所识别，通过囊泡运输机制，以核“芽接”或“水泡”的形式释放染色质和颗粒物质以形成NETs^[12]。该方式不影响中性粒细胞膜功能，即使中性粒细胞变成无核细胞，其仍具有功能^[16]。在机体感染金黄色葡萄球菌期间，显微镜下可观察到感染后数分钟内中性粒细胞通过分泌染色质，释放颗粒蛋白，并于细胞外组装成网，同时留下活跃的无核的细胞质继续吞噬细菌^{[9, 17-19]}。在此途径中，钙通道的激活、肽酰基精氨酸脱亚胺酶的活化，以及组蛋白瓜氨酸化是至关重要的^{[9, 20]}。

2 NETs与炎症反应

在脓毒症中NETs起双重且相反的作用：一方面发挥抗炎作用，控制感染；另一方面又具有促炎作用，诱导组织和器官的损伤^{[14, 21-23]}。

2.1 NETs的抗炎作用

活化的中性粒细胞产生的NETs是一种天然的防御机制，通过网与病原体细胞之间的电荷相互作用捕获微生物，以防止微生物播散，并确保局部有高浓度的抗菌蛋白，以降解毒性因子和杀死病原体^{[12-13, 21, 24]}，同时可促进其他中性粒细胞和吞噬细胞的吞噬作用^[25]。一般来说，NETs中带正电荷的蛋白能通过结合或嵌入微生物表面带有负电荷的脂质双分子层来杀死微生物。NETs中的钙卫蛋白还可通过螯合二价金属阳离子抑制真菌生长。另外，NETs中DNA主链上的磷酸二酯酶键是二价阳离子的强力螯合剂，DNA自身也具有高度的抗菌活性，当组蛋白瓜氨酸化后，组蛋白与DNA之间的结合松弛，使DNA与细菌相互作用并发挥NETs的杀菌作用^[26]。

2.2 NETs的促炎作用

虽然NETs的主要作用是通过其黏性和高浓度抗菌蛋白保护宿主免受微生物入侵，但这些特性也可能使NETs对宿主细胞和组织有害。过多形成的NETs会增加黏液的黏度，使局部组织或细胞过度充盈，损害其功能。另外，抗菌蛋白具有高度的细胞毒性，可诱导内皮细胞和上皮细胞死亡；组蛋白也是损伤相关分子模式，可通过促进促炎细胞因子的释放而导致器官损伤，也可通过诱导细胞毒性和增加ROS的产生而导致内皮功能障碍^[25]。

目前已在脓毒症患者肺组织中发现大量中性粒细胞浸润及NETs，且已证明过量NETs的产生可促进炎症，并损伤组织^{[22, 27]}。小鼠感染甲型H1N1流感病毒后，募集于肺内的中性粒细胞产生过量NETs，其中的组蛋白和金属蛋白酶9（MMP-9）缠于肺泡，也导致肺泡毛细血管损伤。同样在新型冠状病毒所致重症肺炎患者体内发现增多的NETs，可能是晚期促炎介质HMGB1的释放促进NETs的形成，而同时NETs蓄积造成肺组织损伤，也可触发HMGB1的释放，最终导致HMGB1和NETs释放形成相互促进的恶性循环^[16]。在无菌性肺损伤中，NETs持续作用于局部肺组织，肺泡和支气管上皮细胞分泌的IL-6和IL-8显著增加，导致中性粒细胞跨上皮迁移至气道腔；此外，中性粒细胞也能释放IL-8，进而促进自身的趋化和迁移，进一步使肺泡灌洗液NETs水平高于循环中NETs，这进一步证实了肺泡中NETs可激活炎症应答，导致肺部局灶性炎性损伤。在抗体介导引起的输血相关急性肺损伤中中性粒细胞形成NETs时释放出的细胞毒性DNA-蛋白质复合物，如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧物酶、抗菌肽和其他中性粒细胞蛋白酶等，可加重肺部损伤，引起肺损伤与炎症反应相互促进，恶性循环。

除了急性炎症反应，NETs也与慢性炎症性疾病相关。研究发现，铜绿假单胞菌常出现在囊性纤维化患者肺部并诱导NETs形成，一些从临床中分离的铜绿假单胞菌对NETs介导的杀菌作用产生耐受，而且NETs通过为细菌复制提供场所促进肺组织纤维化区域的形成；除了直接损伤组织，NETs还可直接刺激巨噬细胞，促进慢性炎症反应^[13]。

3 NETs与血栓形成

NETs可作为血栓形成的支架，使血小板滞留并被激活，从而阻碍血液流动，同时滞留的血小板还会阻止DNA酶对支架的降解^[12]。此外，NETs的多种组分均能发挥促凝血作用，最终引起血栓形成以及血小板的耗竭，甚至导致凝血功能障碍或DIC。比如，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、金属蛋白酶9和组织蛋白酶G均可对内皮细胞产生直接的毒性作用，诱发血栓形成^[6]；血浆中的循环游离DNA（circulating free DNA, cfDNA）水平与凝血酶生成的程度和速率均呈正相关，cfDNA凭借其双链DNA结构结合蛋白因子XII和激肽，加速前激肽释放酶的激活，促进凝血过程，而且cfDNA不仅通过抑制组织纤溶酶原激活剂来抑制纤维蛋白溶解^[28]，还通过构建由红细胞、血小板、纤维蛋白和凝血因子组成的支架强化微血栓的超微结构^[29]；组蛋白，作为NETs的主要成分之一，可激活Toll样受体，导致凝血酶的产生，并激活血小板，引起血小板的微聚集及血小板减少症；此外，NETs和血小板的相互作用，以及通过HMGB1/ TLR4信号通路介导的血小板激活，均影响凝血级联的激活和弥漫性微血栓的形成^[16]；另外，研究发现脓毒症患者中性粒细胞在形成NETs的同时释放大量的组织因子，组织因子被自噬体吞噬并转移到网中，被网覆盖的组织因子可以进一步捕获循环血小板，形成血栓^[12]，同时NETs通过激活内皮细胞表达的组织因子又可增强组织因子/凝血酶轴^[30]。总之，NETs的形成会增加血栓形成的风险。

4 NETs的临床检测及其意义

由于NETs结构的复杂性，目前尚无统一的用于检测NETs的指标和检测方案。肽酰基精氨酸脱亚胺酶4介导的瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）是NETs形成的标志物，髓过氧物酶-DNA和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA共定位复合物具有高度的特异性，它们都常用于NETs的检测。通过对不同种类的患者血液及组织中NETs的检测，发现肺炎、ARDS、系统性红斑狼疮、癌症等患者血清中NETs组分显著升高^[19]。而输血相关急性肺损伤的小鼠肺泡中也发现丰富的NETs^[26]。在冠状动脉粥样硬化、下肢深静脉血栓形成及房颤患者血栓形成的过程中均伴有大量NETs的形成^[18]。此外，流行性感冒患者中，显著升高的NETs组分与流行性感冒的不良结果有关，是一个区别中度和重度病例的指标^[31]。在呼吸机相关肺损伤患者肺泡中发现显著升高的髓过氧物酶-DNA复合物，并随着细菌负荷的增加而增加^[5]。在急性呼吸窘迫综合征患者中发现循环髓过氧物酶-DNA水平与氧合指数（PaO2/FiO2）呈正相关。在系统性红斑狼疮中，NETs的升高可作为预测疾病活动和肾脏受累、心血管事件的生物标志物^{[3, 32]}。在一项针对近期ST段抬高型心肌梗死患者的研究中发现高水平的dsDNA可独立预测院内主要不良心血管事件^[33]。而在脓毒症患者中显示，大量的循环NETs与预后不良和多器官衰竭有关^[25]。

5 NETs在治疗中的应用

研究发现针对NETs的靶向治疗可能会抑制部分疾病的进展^{[6, 13, 23-25, 33, 34]}。脱氧核糖核酸酶1（DNase 1）可用于囊性纤维化的治疗^{[6, 24]}；输血相关急性肺损伤模型小鼠即使在发病90 min后吸入DNase仍可防止肺泡中NETs聚集并改善动脉血氧饱和度，减少肺水肿^[23-24]；在多种微生物感染小鼠脓毒症模型中，应用DNase1或组蛋白中和抗体联合抗生素治疗可减少器官损伤，提高生存率，但同时也有释放高活性酶和组蛋白等毒性分子的风险，这同样会造成组织损伤^{[13, 34]}。此外，肽酰基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂在急性心肌梗死、脑卒中和糖尿病的治疗中也被证明是有效的^[33]；在小鼠红斑狼疮模型中，肽酰基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂的全身治疗对NETs介导的血管损伤、内皮功能障碍和肾脏损伤均具有保护作用^[25]。除此之外，一些旨在减少NETs形成的药物正在被研究，如抗HMGB1抗体、NADPH/ROS抑制剂等。然而，在急性炎症和血栓形成等急危重症中针对NETs的治疗策略还很少，需要进一步研究。

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