脓毒症是由感染引起的生理、病理和生化异常的综合征。宿主免疫系统在受到外部病原体感染后介导促炎反应，表现为全身炎症反应综合征^[1]。一些流行病学研究表明，脓毒症患者，特别是合并多种并发症的，病死率高。在土耳其的一项国家多中心前瞻性研究中，分析的1 499例患者严重脓毒症和脓毒症休克的病死率(分别为55.7%和70.4%)显著高于普通感染患者^[2-3]。

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一组染色体结合蛋白，可由被活化的巨噬细胞释放到细胞外，在没有外来病原体入侵的情况下，HMGB1可以激活自然免疫炎症反应^[4]。随着HMGB1晚期促炎作用的发现，它被认为是一种重要的炎症介质和脓毒症的潜在治疗靶点^[5-6]。

骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种高度磷酸化的糖蛋白，它可以促进免疫介导疾病和炎症性疾病的进展，调节宿主对感染的反应^[7]。既往研究表明，血清OPN水平在脓毒症患者中显著升高，可能作为炎症介质在疾病进展中发挥重要作用^[8]，但OPN参与脓毒症病理过程的具体调控机制及可能涉及的细胞生物学改变尚不清楚。最近研究发现，在丙型肝炎病毒引起的肝纤维化患者中，OPN和HMGB1的表达水平存在相关性，且OPN被认为是HMGB1的上游因子，OPN可以诱导HMGB1并在HSCS中调控I型胶原的合成^[9]。然而，关于它们之间的关系及其作用机制的研究却很少。本实验旨在通过体外培养巨噬细胞，观察OPN水平对脓毒症中HMGB1表达水平的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

RAW264.7细胞系购自上海细胞库。OPN购自R & D System公司。脂多糖购自Sigma-Aldrich公司。IL-1β ELISA试剂盒购自北京四正白公司。引物由上海圣工公司合成提供。Monad qPCR试剂盒购自苏州mona生物技术公司。mRNA逆转录试剂盒购自北京天根生化技术公司。HMGB1和Tubulin小鼠单克隆抗体购自Abcam公司。

1.2 分组干预

用含10%胎牛血清DMEM体外培养RAW264.7细胞。细胞在0.25%胰酶的作用下充分消化，当大多数细胞从瓶底脱落时，加入完全培养基阻止消化，然后离心收集。收集计数后，10⁶ /mL细胞接种于6孔板，每孔2 mL。当细胞达到底壁50%时，按实验设计将细胞分组进入实验程序。对照组: 只使用DMEM培养基; LPS+ATP干预组: LPS 1 μg/mL处理6 h, ATP 5 mmol/l处理0.5 h。OPN+LPS+ATP干预组: 先用0.1 μg/mL OPN处理细胞12 h，再加入LPS+ATP，处理时间与第二组相同。三组细胞均培养48 h。

1.3 ELISA法检测IL-1β

各组细胞按上述方法处理后按照试剂盒说明书检测IL-1β的含量。

1.4 RNA扩增及RT-PCR

取药物处理细胞的6孔板，每孔加入1 mL TRIZOL，促进细胞充分裂解。按照RNA提取的实验步骤提取所有RNA，然后用核酸蛋白分析仪检测收集到的RNA总浓度。根据逆转录试剂盒的指示将mRNA逆转录为cDNA，保存于-20℃备用。GAPDH: 引物: 5'-aacgaccccttcattgac-3'，5'-tccacgacatactcagcac-3'。HMGB1引物: 5'-cgaaggctatcacaagaac-3'，5'-ataaagggacaaaccacag-3';使用mRNA逆转录试剂盒引物从分离的RNA中合成第一链cDNA，然后使用Monad qPCR试剂盒在QuantStudio^TMReal-time PCR软件中进行实时PCR。先在95℃变性5 min，然后进行40个循环，包括以下步骤: 95℃变性30 s，60℃退火和延伸60 s。

1.5 Western Blot测HMGB1蛋白

药物刺激48 h后，各组细胞加入RIPA 30 min。4℃离心后取上清液，测量上清液蛋白浓度并进行调整。加入上样缓冲液，100℃加热7 min, SDS-PAGE分离转移至PVDF膜，5%脱脂乳封闭1 h，抗HMGB1(1:50 000)/抗tubulin(1:100 00)4℃孵育过夜。第2天使用TBST清洗, 室温下二抗(1:5 000)孵育1 h, TBST洗涤后, 使用ECL发光液成像, 得出图形后分析比较。

1.6 统计学方法

使用GraphPad Prism 5.0对实验数据进行分析。数据以以均数±标准差（Mean±SD）表示。组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用成组t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 细胞状态

细胞形态与脓毒症模型鉴定: 细胞贴壁，形态以圆形、不规则为主，一般有1~2个核。显微镜下，细胞呈圆形或椭圆形，成片生长，最终形成一个或甚至成层状(图 1A)。经过LPS+ATP(脓毒症诱导药物)处理后，显微镜下可见大部分巨噬细胞被入侵并分化，细胞体增大，形态不规则，生成大量伪足(图 1B)。

2.2 IL-1β的表达

ELISA结果显示: 与对照组相比，LPS+ATP组IL-1β表达显著升高，提示LPS+ATP可以激活IL-1β的表达(P < 0.01)。与LPS+ATP组相比，OPN组IL-1β表达明显下降(P < 0.01)，说明OPN组IL-1β表达受到抑制并下降(图 2)。

2.3 OPN抑制HMGB1 mRNA的表达

PCR结果显示，与对照组相比，LPS+ATP组HMGB1 mRNA表达增加，且表达差异显著，说明LPS刺激可增加RAW264.7细胞HMGB1 mRNA的表达量; 与LPS+ATP组相比，OPN组HMGB1 mRNA表达下降，且表达差异显著(图 3)，说明OPN处理可下调RAW264.7细胞中HMGB1 mRNA的表达。

2.4 OPN抑制HMGB1蛋白的表达

Western Blot结果显示，与对照组相比，LPS+ATP组HMGB1蛋白表达水平升高，差异有统计学意义，说明脓毒症细胞模型中HMGB1蛋白表达水平显著升高。与LPS+ ATP组比, OPN的表达HMGB1蛋白下降, 表达差异显著, 表明OPN可以抑制HMGB1水平在脓毒症细胞模型(图 4)。灰度数据图(图 5)。

3 讨论

脓毒症的病理生理机制复杂，目前认为其重要机制为宿主促炎、抗炎反应失衡、凝血系统功能障碍、多器官功能障碍、线粒体功能障碍和免疫反应抑制^[10-15]。脓毒症初期，促炎因子大量释放，而负反馈导致IL-10和可溶性TNF受体等抗炎因子的产生^[16]。随着脓毒症的进展，许多促炎因子被消耗，患者进入长时间的免疫抑制状态。此外, 外界刺激如内毒素可以诱导中性粒细胞与内皮细胞释放一系列的介质, 包括前列腺素、活性氧和蛋白酶, 可以干扰内皮一氧化氮合酶的形成, 进一步损伤内皮细胞, 导致微循环灌注异常, 甚至器官功能障碍^{[14, 17]}。

HMGB1被认为是一种主要参与脓毒症的炎性细胞因子，促进炎性细胞因子的释放和炎症级联反应，影响多器官衰竭^[18]。Gregoire等^[19]通过建立多细胞腹膜炎小鼠模型，证明抗HMGB1治疗可显著降低脓毒症诱导的中性粒细胞NADPH氧化酶活性紊乱。他们的数据表明，晚期脓毒症中HMGB 1的积累在晚期脓毒症免疫抑制的发展中起着特殊的作用。此外，巨噬细胞在感染过程中可以分泌炎症因子HMGB1，且脓毒症患者血浆HMGB1水平的持续升高与脏器功能障碍程度及最终结局相关^[20]。HMGB1可通过受刺激的单核细胞和巨噬细胞表达，并通过坏死或受损细胞被动释放，诱导相关炎症和分解代谢作用。虽然在非炎症条件下，HMGB1几乎存在于所有细胞的细胞核中，但在炎症过程中，通过翻译后修饰，HMGB1可迅速转移到细胞的其他部位，如细胞质和细胞外^[21-22]。

既往研究证实HMGB1和OPN在脓毒症中均有表达，但两者之间是否存在相关性以及两者之间的关系尚不清楚^[23]。OPN是否影响脓毒症中HMGB1的表达，国内外尚无报道。本研究结果显示，在OPN治疗12 h、LPS干预6 h、ATP干预0.5 h后，与对照组相比，HMGB1表达下调，这与其他疾病报道的结果不一致。核因子KB(Nuclear factor KB, NF-KB)信号通路是多种炎症介质细胞内信号转导的共同途径。研究表明重组OPN具有保护作用，并与NF-KB通路失活相关^[24]。本研究结果显示，OPN在脓毒症细胞模型中抑制了炎性因子HMGB1的表达，此前已证实HMGB1与炎性因子之间存在相互增强的关系。因此，推测OPN可能通过引起NF-KB通路失活，导致炎症介质表达降低，从而在巨噬细胞中发挥保护作用。此外，Heilmann等^[25]发现OPN在调节肠道炎症方面是一把双刃剑，敲除OPN导致急性结肠炎小鼠TNF-α水平升高。可能的机制是激活先天免疫系统，减少组织损伤。在脓毒症中，HMGB1通过促进炎症因子IL-1β、TNF-α的表达而引发级联反应，从而促进器官功能障碍。以上文献支持本研究结果，推测其机制可能是OPN导致细胞内炎性因子表达下调，从而影响HMGB1表达下调。但具体的机制还有待进一步研究和确定。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突。