2021, Vol. 30
脓毒症发生时，肠黏膜屏障功能最易受损，容易发生肠道菌群及内毒素移位，导致患者感染加重，甚至启动多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，导致死亡[1], 因此保护肠道屏障功能是防治脓毒症的重点。研究表明[2]，肠黏膜屏障功能受损与炎症反应密切相关，高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种晚期炎症介质[3]，可诱导晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end-products, RAGE)、Toll样受体（toll-like receptor，TLR）2/4、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）等炎症因子释放导致多器官功能损伤，但其在脓毒症肠黏膜屏障损伤中的作用及机制仍需进一步探讨。人结肠腺癌细胞（Caco-2细胞)可以在体外构建单层肠上皮细胞，是目前研究肠道通透性最常用的方法。本研究以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立体外肠上皮屏障功能损伤模型，观察肠上皮屏障功能损伤、肠道HMGB1及下游核转录因子NF-κB的表达，进一步探讨脓毒症时肠黏膜屏障损伤发病机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料DMEM高糖培养基（美国Corning公司），胎牛血清（美国Corning公司），Transwell小室（美国Corning公司），EVOM细胞电阻仪（美国WPI公司）；LPS（美国Sigma公司），丙酮酸乙酯（EP）（美国Sigma公司），FITC-右旋糖酐（美国Sigma公司）；兔抗人Occludin单克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗鼠HMGB1，NF-κB单克隆抗体（美国Abcam公司）；GoTag qPCR Master Mix荧光定量染料法预混液（美国Promega公司）；引物序列由上海生工生物工程有限公司提供。Caco-2细胞株购自中国科学院昆明动物所细胞库，实验在云南大学附属医院中心实验室完成。
1.2 Caco-2细胞培养Caco-2细胞用含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养液，在37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，每日倒置显微镜观察细胞两次，隔天换新鲜培养液一次，待细胞生长至80%密度时，开始传代，也可按照实验需要消化细胞传代培养。
1.3 Caco-2细胞单层上皮屏障模型的建立取对数生长期的Caco-2细胞，将200 μL细胞悬液接种于Transwell-24小室内，外室内加600 μL培养液，接种后1周内每48 h换液，l周以后每24 h换液，每天在倒镜显微镜下观察小室内细胞生长状况，定期用EVOM细胞电阻仪检测小室底层细胞TEER值（具体操作方法参照仪器说明书），当TEER值稳定达到500 Ω•cm2以上时[4]，可认为模型建立成功。
1.4 实验分组当Caco-2细胞单层上皮屏障模型的建立时，将其分为对照组，LPS组，LPS+EP组，对照组加入等容量的DMEM高糖培养，LPS和EP的处理浓度分别为100 μg/mL、50μg/mL。
1.5 Caco-2细胞肠屏障跨上皮电阻(TEER)测定将Caco-2细胞在Transwell-24孔小室内培养，应用跨膜电阻仪自隔日测定TEER值，当TEER值稳定达到500 Ω•cm2以上时，给予以上分组及处理，分别于处理后12、24、48、72 h用EVOM电阻仪测量各组TEER值，选取Transwell小室三个不同方向的点，检测该点的TEER，每点重复测3次，取平均值即为该样品的TEER值，结果以Ω•cm表示（具体操作方法参照仪器说明书）。
1.6 Caco-2细胞单层通透性FITC-右旋糖酐通透率的检测同上述将Caco-2细胞在Transwell-24孔小室内培养，TEER值达500 Ω·cm 2后分别给予以上分组及处理，于37 ℃温箱中孵育24 h。将小室中的培养液吸出，无菌PBS润洗3次，向内室中加入100 μL的FITC-右旋糖酐（1 g/L），外室中加入无菌PBS。避光置于培养箱中孵育1 h，1 h后在外室取样100 μL于黑色96孔板中，实用酶标仪检测FITC的荧光强度值。
1.7 蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测Occludin、HMGB1、NF-κB蛋白表达将Caco-2细胞接种到6孔板中，带细胞融合达80%时，分别给予以上分组及处理，24 h用细胞裂解液提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE电泳，转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，加入相应的一抗（抗Occludin、抗HMGB1、抗NF-κB抗体）稀释液，4℃过夜孵育，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液室温孵育2 h，化学发光法进行显影。β-actin作为内参，运用Image-J软件测量条带的灰度值，进行数据统计分析。
1.8 实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测Occludin、HMGB1、NF-κB mRNA表达将培养的Caco-2细胞制成单细胞悬液，细胞计数后以1×106个/mL密度均匀接种于6孔板，2 mL/孔。细胞融合达80 %时，分别给予以上分组及处理，培养24 h后用Trizol试剂法提取细胞总RNA。按照用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，RT-PCR仪上扩增。引物序列为：Occludin引物正向：5’-CTTCCTCTGAGTGCTGGGTG-3’，反向：5’-TACGCAGGAGTGGAAACTCG-3’；HMGB引物正向：5’-CTTTTGTCCACACACCCTGC-3’，向：5’-CCCATGGTGTGACAGAATTG-3’；NF-κB引物正向：5’-AACGCGTCCAACCTGAAGAT-3’，向：5’-TGTCTGTGAACATCCGTGGG-3’；2-ΔΔCt法对基因表达量进行相对定量。
1.9 统计学方法应用SPSS 21.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Caco-2细胞形态学倒置显微镜下可见对照组细胞贴壁良好，均匀分布，形态规则呈铁丝网状，漂浮细胞少，换液后消除，见图 1A。LPS组较对照组细胞数目显著减少，分布不均匀，细胞形态不规则，部分区域有缺失空洞形成，沿孔洞边缘有片状单层细胞飘起，培养液浑浊，漂浮细胞多，见图 1B。LPS+EP组较LPS组细胞数量多，漂浮细胞较少，折光性较好，培养液较清，见图 1C。
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| 图 1 各组Caco-2细胞24 h形态图（100×） Fig 1 Caco-2 cell images after 24 h of treament in each group(100×) |
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对照组TEER值随时间的变化趋势不明显，LPS组及LPS+EP组各时间段随着时间的推移，TEER值明显减少，变化趋势相同，LPS组较LPS+EP组下降趋势更明显，说明LPS+EP组随肠黏膜屏障有保护作用。各时间点上两组间比较，与对照组相比，LPS组12、24、48、72 h TEER值明显减少，差异有统计学意义（P < 0.01），与LPS组比较，LPS+ EP组12、24、48、72 h TEER值增加（P < 0.01）。见表 1。
| 组别 | TEER值（Ω·cm2） | ||||
| 0 h | 12 h | 24 h | 48 h | 72 h | |
| 对照组 | 522.22±22.93 | 514.22±12.59 | 521.65±13.35 | 523.99±8.18 | 491.21±6.72 |
| LPS组 | 424.53±10.45 | 304.96±9.69a | 276.21±7.82a | 206.64±15.85a | 156.33±10.8a |
| LPS+EP组 | 533.31±9.45b | 519.00±5.66 b | 504.69±8.57 b | 453.65±10.74b | 385.28±7.57b |
| 注：与对照组同时间段比较，aP < 0.05；与LPS组同时间段比较，bP < 0.05；TEER，跨上皮电阻 | |||||
与对照组相比，LPS组24 h时FITC-右旋糖酐通透率明显增加，差异有统计学意义（P < 0.01）；与LPS组比较，LPS+EP组24 h时FITC-右旋糖酐通透率明显减少，差异有统计学意义（P < 0.01），见表 2。
| 组别 | PF（24 h） |
| 对照组 | 1.04±0.06 |
| LPS组 | 2.58±0.07a |
| LPS+EP组 | 1.23±0.11b |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.05 | |
与对照组相比，LPS组Occludin蛋白及mRNA表达减少，HMGB1、NF-κB蛋白及mRNA表达明显增加，差异均有统计学意义（P < 0.01）；与LPS组比较，Occludin蛋白及mRNA表达明显增加，HMGB1、NF-κB蛋白及mRNA表达减少，差异均有统计学意义（P < 0.01），见表 3、图 2。
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| Occludin为缝隙连接蛋白，HMGB1为高迁移率族蛋白B1，NF-κB p65为核因子-κB 图 2 各组Caco-2细胞HMGB1、NF-κB、Occludin蛋白的表达 Fig 2 The relative protein expression levels of Occludin, HMGB1, NF-κB in Caco-2 cells of each group |
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与对照组相比，LPS组Occludin mRNA表达减少，HMGB1、NF-κB mRNA表达水平明显增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）；与LPS组比较，LPS+ EP组Occludin mRNA表达明显增加，HMGB1、NF-κB mRNA表达水平减少，差异均有统计学意义（P < 0.05），见表 4。
| 组别 | HMGB1 | NF-κB | Occludin |
| 对照组 | 0.253±0.009 | 0.526±0.039 | 1.078±0.051 |
| LPS组 | 0.772±0.031a | 1.212±0.063a | 0.643±0.041a |
| LPS+EP组 | 0.482±0.053ab | 0.783±0.043ab | 0.825±0.046ab |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.05 | |||
| 组别 | HMGB1 | NF-κB | Occludin |
| 对照组 | 1.054±0.028 | 1.039±0.013 | 1.033±0.017 |
| LPS组 | 2.519±0.136a | 3.592±0.169a | 0.559±0.046a |
| LPS+EP组 | 1.804±0.029ab | 2.286±0.373ab | 0.824±0.046ab |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与LPS组比较，bP < 0.05 | |||
脓毒症时，肠屏障功能最易受损，而肠屏障功能受损后所导致的菌群移位又可加重脓毒症的发生发展，因此如何维持肠屏障功能的正常已成为危重症领域研究的热点[5-7]。脓毒症时炎症细胞因子在肠黏膜屏障损伤中具有重要作用，HMGB1作为一种晚期炎症细胞因子，因出现时间晚且持续时间长，可能成为潜在干预目标[4, 8]。目前研究表明，HMGB1可释放到胞外，发挥促炎因子的功能，其表达增加可影响肠黏膜生物屏障功能[9-10]，但具体机制仍不清楚。本研究以Caco-2细胞为研究对象，以LPS构建体外单层肠上皮细胞损伤模型，建模成功后研究其肠屏障的损伤是否与“晚期”炎症因子HMGB1及下游信号分子NF-κB表达有关，旨在为脓毒症肠屏障功能损伤的治疗提供新的思路。
本研究选用的Caco-2细胞系在体外培养条件下可以分化形成单层的细胞，表达成熟的上皮细胞的形态和功能，是目前研究肠道通透性最常用和最成功的方法[11-12]。Caco-2细胞单层上皮屏障建立前需要对模型进行完整性评价，常用的指标是检测TEER值，不同实验条件下Caco-2细胞测得的TEER值差别较大，本实验参考Natoli等[4]构建Caco-2细胞肠上皮转运模型，当TEER值稳定在 > 500 Ω•cm2，可认为肠上皮单层细胞模型构建成功。因此本实验Caco-2细胞单层上皮模型的TEER值达到500 Ω•cm2，可认为肠上皮模型构建成功。此外FITC-右旋糖酐通过率也是检测Caco-2细胞单层屏障功能变化的敏感指标。TEER值的降低和FITC-右旋糖酐增高，提示对物质的通透性升高，肠上皮屏障完整性破坏。本实验中LPS处理后，Caco-2单层细胞屏障的TEER值降低，FITC-右旋糖酐通过率显著增高，提示Caco-2单层细胞屏障受到了的损伤，且随着时间的延长损伤有加重的趋势（时间依赖性）。而在LPS处理同时加入HMGB1的抑制剂丙酮酸乙酯时TEER值增加，FITC-右旋糖酐通过率明显减少，说明HMGB1的抑制剂能改善LPS对肠上皮屏障完整性的有害刺激，具有保护作用。肠黏膜上皮屏障主要由上皮细胞及其周围的紧密连接所组成。紧密连接(tight junction，TJ)是构成上皮细胞屏障功能最重要的结构，而Occludin蛋白是紧密连接结构中目前了解最为清楚的跨膜蛋白，Occludin蛋白的缺失可引起肠上皮屏障通透性的增高，因此Occludin蛋白是检测紧密连接损伤的常用指标[13]。本实验结果显示，LPS能显著降低Caco-2细胞内Occludin蛋白及mRNA的表达，HMGB1的抑制剂丙酮酸乙酯能改善LPS引起的Occludin蛋白和mRNA的表达。说明LPS可导致细胞间紧密连接结构破坏，而丙酮酸乙酯对LPS诱导的Caco-2细胞间紧密连接结构破坏具有保护作用。
脓毒症时产生的大量炎症细胞因子介导了肠黏膜屏障损伤。HMGB1作为一种晚期炎症介质参与了脓毒症的发病过程，是脓毒症促炎细胞因子反应网络的中心环节，其表达增加与脏器功能损害密切相关。HMGB1分泌到细胞外发挥促炎作用，主要是通过与其受体（TLR2/4、RAGE）结合，激活下游信号通路，促进NF-κB核内转移，诱导一系列炎症细胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等释放，促进炎症级联反应，最终介导肠黏膜的损伤[14-17]。因此抑制或阻断HMGB1-NF-κB信号通路，可以保护肠黏膜屏障功能免受损伤。丙酮酸乙酯是HMGB1的抑制剂，能有效减少脓毒症小鼠血液中HMGB1浓度，并可明显抑制NF-κB的活化，从而发挥抗炎等作用。近年来的研究表明，丙酮酸乙酯可明显改善脓毒症所致的肠屏障功能的损伤[18-19]。本实验结果显示，LPS组HMGB1蛋白及mRNA表达水平明显增高，而LPS加EP组抑制了HMGB1的表达，提示HMGB1可能在脓毒症肠屏障功能损伤中发挥关键作用。此外，本研究结果进一步显示，LPS组除了高表达HMGB1外，其下游信号分子NF-κB蛋白及mRNA水平亦较对照组明显升高，而HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯组NF-κB表达水平明显减少，提示脓毒症时HMGB1的高表达可促进其下游信号分子NF-κB的激活，进而发挥炎症级联反应，促进肠黏膜的损伤，丙酮酸乙酯能显著逆转HMGB及其信号分子NF-κB的表达，改善肠黏膜屏障功能，对脓毒症肠黏膜损伤具有保护作用。
综上所述，脓毒症时肠上皮屏障完整性受损，肠细胞间紧密连接蛋白表达减少，其机制可能与炎症因子HMGB1表达上调促进其下游信号分子NF-κB的激活有关。因此，HMGB1有望成为治疗脓毒症肠道功能障碍的新的靶点。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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