创面修复是指由于致伤因子的作用造成组织缺失后，局部组织通过再生、修复、重建，进行修补的一系列病理生理过程。创面修复一直是医学重点研究方向。皮肤组织创伤后机体自发产生应激反应，激活免疫细胞，并释放多种炎症介质及细胞因子，而导致一连串的连锁反应，适度的炎症反应可以保护创面，促进创面愈合，但过度的炎症反应会导致机体免疫功能紊乱，不利于创面愈合^[1]。很多文献已证实巨噬细胞在创伤修复中具有重要地位^[2-3]。在创面巨噬细胞可分为两大类：促炎的M1巨噬细胞和抑炎促纤维化的M2型巨噬细胞。M2型巨噬细胞在创面愈合后期起着非常重要的作用，促进血管生成、胶原沉积^[4]。因此调控巨噬细胞极化可能对创面修复有重要作用。

生长停滞特异基因6（growth arrest-specific gene6，Gas6）蛋白是由Gas6基因编码的，与蛋白S 44%同源，它是依赖维生素K蛋白家族中的一员。Gas6蛋白主要与Gas6受体TAM（Tyro3、Axl、Mer）相互结合，发挥调节细胞免疫、炎症、增殖、迁移、黏附和凋亡的作用^[5-7]。有研究发现Gas6参与巨噬细胞极化^[8]，因此本研究主要探讨Gas6对皮肤缺损小鼠巨噬细胞极化的影响及创面修复的作用。

健康雄性清洁级B6小鼠，质量20~25 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。小鼠饲养及动物实验在温州医科大学实验动物中心进行。实验遵循国际通行的动物福利和伦理准则。Recombinant Mouse Gas6（R & D公司，明尼阿波利斯，美国），F4/80-FITC、CD163-PE及CD197-APC抗体（BD公司，新泽西州，美国），超纯RNA提取试剂（TaKaRa公司，大连，中国），反转录试剂盒（TaKaRa公司，大连，中国），Real-time PCR试剂盒（TaKaRa公司，大连，中国），IL-6、IL-10 ELISA检测试剂盒(上海依科赛生物科技有限公司，上海，中国)。

采用清洁级雄性B6小鼠随机（随机数字法）分为正常组（normal）、皮肤缺损组（Skin defect）、皮肤缺损组+生理盐水（PBS）组、皮肤缺损+Gas6（1 μg）组、皮肤缺损+Gas6（5 μg）组和皮肤缺损+Gas6（10 μg）组，每组16只。正常组无特殊处理，皮肤缺损组首先小鼠背部剃毛、消毒，用4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，用直径2 cm皮肤打孔器打孔，切除打孔处全层皮肤组织，用透明敷贴覆盖创面，小鼠单笼饲养。皮肤缺损组+生理盐水组在造模后创口周围注射100 μl生理盐水。Gas6处理组先用1 μg、5 μg、10 μg不同剂量的Gas6蛋白溶于100 μL的生理盐水中备用，然后各组制作皮肤缺损模型，制作完毕后立即在小鼠皮肤缺损周围皮下注射溶于生理盐水的Gas6溶液，按摩皮损周围皮肤，使Gas6蛋白溶液充分吸收。每组10只用来观察小鼠的创口愈合情况，剩余6只在造模后第5天处死小鼠，切取创面组织。

造模后第5天断颈处死小鼠，切取创面组织，无菌PBS清洗2次，75%的医用酒精浸泡3 min，再无菌PBS清洗2次，去除皮下的脂肪组织，将创面组织切割，加入胰蛋白酶消化过夜，去除已经消化松脱的表皮和被毛，真皮组织用无菌PBS清洗3次，剪成1 mm的碎块，加入0.1%胶原酶，消化30 min，将消化好后所得的细胞悬液过150目不锈钢网筛，获得细胞悬液，然后不连续密度梯度离心，获得细胞置于培养瓶中，37℃培养2 h后，用培养基吹打细胞，吸弃上清液，重复操作3次，洗去未贴壁的细胞，得贴壁细胞。然后调整细胞数，加入F4/80-FITC、CD163-PE及CD197-APC抗体，避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞表型。

用10%FBS RPML-1640完全培养基重悬巨噬细胞，调整细胞浓度至1×10⁶/mL，取l mL/孔接种于24孔培养板，置入37℃ 5%CO₂孵箱内继续培养。24 h后同时收集各组细胞上清液，取各组培养液上清液，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测各组上清液中IL-6，IL-10含量，按说明书步骤操作。

提取各组创面组织巨噬细胞，每1×10⁶细胞加入1 mL Trizol裂解液提取各个样本总RNA，测定RNA浓度，反转录合成互补DNA。由生工生物工程股份有限公司设计合成引物。Arg-1上游引物为5’ -GCTCAGGTGAATCGGCCTTTT-3’，下游引物为5’ -TGGCTTGCGAGACGTAGAC-3’，iNOS上游引物为5’ -CCCTGGTGCAGGGAATCTT-3’，下游引物为5’ -TAGCTGCCGCTCTCATCCA-3’，β-actin上游引物为5’ -GGCTCCTAGCACCATGAAGA-3’，下游引物为5’ -CCACCGATCCACACAGAGTA-3’。采用△循环阈值(Ct)法处理结果，计算目的基因的相对表达量，即2^-△△CT。

造模后第5天断颈处死小鼠，取切口周围1 cm处皮肤组织，剔除结缔组织，取1 mm×1 mm×1 mm组织，置于4%甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋切片，制作5 μm切片，常规苏木精-伊红染色(H & E)及Masson染色，光学显微镜下观察肺组织病理变化。Masson染色胶原纤维呈蓝色，以胶原面积与视野面积的比值反应胶原表达，取5个视野的平均值。

应用SPSS 23.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（Mean ± SD）表示，两组样本比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用单因素方差分析；计数资料以百分比表示，比较采用χ²检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

图 1所示，伤口形成后第3天，伤口表面开始结痂，Gas6治疗组伤口面积略小于PBS对照组，第7天Gas6治疗组伤口愈合情况明显优于对照组，且Gas6 5μg组和10 μg组效果明显，具有明显的剂量依赖效应。Skin defect模型组7 d皮肤愈合率为10%，10 d愈合率为30%，14 d愈合率为80%，PBS对照组7 d皮肤愈合率为20%，10 d皮肤愈合率为30%，14 d愈合率为90%；Gas6 1 μg治疗组7 d皮肤愈合率为30%，10 d皮肤愈合率为60%，14 d愈合率为100%；Gas6 5 μg治疗组7 d皮肤愈合率为40%，10 d皮肤愈合率为70%，14 d愈合率为100%；Gas6 10 μg治疗组7 d皮肤愈合率为40%，10 d皮肤愈合率为80%，14 d愈合率为100%。

与PBS组比较，aP < 0.05 图 1 Gas6促进小鼠皮肤伤口愈合 Fig 1 Gas6 promotes skin wound healing in mice

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制作小鼠皮肤缺损模型，不同剂量的Gas6干预后，流式细胞术检测M1巨噬细胞和M2巨噬细胞标记物表达，如图 2所示，与正常组相比，皮肤缺损组小鼠巨噬细胞CD197的比例升高明显（P=0.0049），而Gas6干预后，CD197的比例明显下降（P=0.000）。如图 3所示，与正常组相比，皮肤缺损组小鼠巨噬细胞CD163和F4/80双阳性的比例明显降低（P=0.0086），而Gas6治疗后，CD163和F4/80双阳性比例明显升高（P=0.000），且Gas6 10μg组效应最明显，具有明显的剂量依赖效应。说明皮肤缺损后巨噬细胞向M1转化，而一定剂量的Gas6治疗后，巨噬细胞可向M2转化。

与normal组比较，aP < 0.05；与Skin defect组比较，bP > 0.05；与PBS组比较，cP < 0.05 图 2 Gas6对皮肤缺损小鼠巨噬细胞CD197的影响 Fig 2 The effect of Gas6 on macrophage surface marker CD197 in mice with skin defect

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与normal组比较，aP < 0.05；与Skin defect组比较，bP > 0.05；与PBS组比较，cP < 0.05 图 3 Gas6对皮肤缺损小鼠巨噬细胞CD163和F4/80的影响 Fig 3 The effect of Gas6 on macrophage surface marker CD163 and F4/80 in mice with skin defect

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为进一步评估巨噬细胞分泌细胞因子的能力，本实验提取了造模后5 d的巨噬细胞，培养后检测上清液中IL-6、IL-10水平，如图 4所示，正常组IL-6为（89±6.396）pg/mL，与正常组相比，皮肤缺损组IL-6水平明显升高（P=0.0013），与PBS对照组相比，Gas6治疗组IL-6水平明显降低（P=0.000）。如图 5所示，正常组IL-10为（60±5.774）pg/mL，与正常组相比，皮肤缺损组IL-10水平明显升高（P=0.0014），与PBS对照组相比，Gas6治疗组IL-10水平明显升高（P=0.0003），且Gas6 10μg组效应最明显，具有明显的剂量依赖效应。

与normal组比较，aP < 0.05；与Skin defect组比较，bP > 0.05；与PBS组比较，cP < 0.05 图 4 Gas6对皮肤缺损小鼠巨噬细胞分泌IL-6的影响 Fig 4 The effect of Gas6 on IL-6 secretion by macrophages in mice with skin defect

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与normal组比较，aP < 0.05；与Skin defect组比较，bP > 0.05；与PBS组比较，cP < 0.05 图 5 Gas6对皮肤缺损小鼠巨噬细胞分泌IL-10的影响 Fig 5 The effect of Gas6 on IL-10 secretion by macrophages in mice with skin defect

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iNOS、Arg-1也分别是M1和M2型巨噬细胞的标记物，因此本实验也检测了造模后5 d的巨噬细胞中iNOS、Arg-1的mRNA水平，如图 6所示，与正常组相比，皮肤缺损组iNOS mRNA水平明显升高（P=0.008），与PBS对照组相比，Gas6治疗组iNOS mRNA水平明显降低（P=0.0018），且Gas6 10μg组效应最明显，具有明显的剂量依赖效应。如图 7所示，与正常组相比，皮肤缺损组Arg-1 mRNA水平明显降低（P=0.0121），与PBS对照组相比，Gas6治疗组Arg-1 mRNA水平明显升高（P=0.001），且Gas6 10μg组效应最明显，具有明显的剂量依赖效应。

与normal组比较，aP < 0.05；与Skin defect组比较，bP > 0.05；与PBS组比较，cP < 0.05 图 6 Gas6对皮肤缺损小鼠巨噬细胞iNOS的影响 Fig 6 The Effect of Gas6 on iNOS in macrophages of mice with skin defect

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与normal组比较，aP < 0.05；与Skin defect组比较，bP > 0.05；与PBS组比较，cP < 0.05 图 7 Gas6对皮肤缺损小鼠巨噬细胞Arg-1的影响 Fig 7 The effect of Gas6 on Arg-1 in macrophages of mice with skin defect

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图 8 各组小鼠皮肤病理学改变（×400） Fig 8 Skin pathological changes of mice in each group (original magnification×400)

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图 9 各组小鼠皮肤伤口胶原纤维形成（×400） Fig 9 Collagen fiber formation in skin wounds of mice in each group (original magnification×400)

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组织病理学观察了第5天的修复情况，HE染色结果表明，与正常组相比，皮肤缺损组炎性细胞增多，细胞排列紊乱，组织水肿，Gas6治疗组炎性细胞较少，成纤维细胞增多，部分组织可见肉芽组织形成。Masson染色可见正常组胶原纤维丰富，排列整齐，皮肤缺损组胶原纤维减少，排列紊乱，Gas6治疗组蓝色的胶原纤维的形成明显较PBS组增多，且Gas6 10 μg组最明显，具有明显的剂量依赖效应。

创面的愈合一直是研究重要难题，皮肤创面形成后会激活机体免疫应答，一方面调节中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞等炎性细胞的趋化、增殖等，另一方面通过产生一些细胞因子调节参与伤口修复的组织细胞如血管内皮细胞、表皮细胞和成纤维细胞。因此如何调控创面炎症反应和免疫应答已成为研究创面愈合再生的重要方向。

巨噬细胞是创面免疫应答和炎症调控的关键细胞^[9-10]，巨噬细胞不但能清除并吞噬坏死组织、病原微生物和其他机体组织中的异物，并且能够分泌细胞因子，进而起到修复细胞、刺激细胞增殖、胶原沉积、促进血管化和肉芽新生的作用^[11]。巨噬细胞主要可分为M1型即经典激活的巨噬细胞和M2型即选择性激活的巨噬细胞，不同表型的巨噬细胞在创面修复中发挥不同作用，其中M1型巨噬细胞在炎症反应中促使分泌炎性因子如IL-6，起到促炎作用，M2型巨噬细胞促进创面细胞分裂及胶原形成，并通过释放IL-10等抗炎因子发挥抑炎作用^[12]。有研究表明槲皮素可使巨噬细胞从M1极化到M2极化，纤维细胞分布和胶原沉积明显高，CD206阳性细胞较多，iNOS阳性细胞较少，促炎因子水平降低，抗炎因子和血管生成相关因子水平升高，促进糖尿病伤口愈合^[13]。也有研究^[14]表明，M1和M2巨噬细胞与人类真皮成纤维细胞（HDF）共培养，M2巨噬细胞可显著促进成纤维细胞增殖，增加胶原蛋白含量，促纤维化基因的表达，降低抗纤维化基因的表达和MMP-1活性，而与M1型巨噬细胞共培养的成纤维细胞则相反。Klinkert等^[15]通过CSF-1信号传导阻断减少手术伤口中M2巨噬细胞，导致持续性炎症，嗜中性粒细胞和M1巨噬细胞增加，减弱胶原沉积。Ganta等^[16]利用MicroRNA93调节巨噬细胞极化，以促进严重外周动脉疾病（PAD）患者血管生成，表明M2样极化更有利于增强PAD中的血管生成和灌注恢复；将M1和M2型巨噬细胞与微血管内皮细胞共培养，发现与M2共培养的微血管内皮细胞增殖速率是与M1共培养的3~3.5倍，增强血管生成，提示促血管化能力方面M2强于M1 ^[17]。综上所述，巨噬细胞M2型极化可能更有利于创面愈合。

Gas6蛋白具有调节炎症与免疫以及促进生长作用，在很多疾病中起着减轻脏器损伤的作用。在脓毒症中，Gas6蛋白5 µg剂量可减轻脓毒症小鼠中性粒细胞迁移和急性肺损伤^[18]。也有研究用三种不同浓度的Gas6蛋白（1、5、10 µg）可以减轻脓毒症小鼠肺损伤和肾损伤，且在10 µg剂量时效应最明显^[19-20]，因此在本研究中选用了1、5、10 µg三个浓度来研究。创面修复可分为3个阶段：炎症期、纤维组织增生期、瘢痕形成修复期，胶原纤维在其中起着重要作用。本研究建立小鼠全层皮肤缺损模型，通过不同剂量Gas6治疗后，检测了M1的标记物CD197、iNOS及促炎因子IL-6和M2型标记物CD163、F4/80、Arg-1及抑炎因子IL-10、并观察了伤口病理改变和愈合情况。结果得出Gas6治疗后皮肤缺损小鼠巨噬细胞M1向M2极化，并且Masson染色见明显的胶原纤维，伤口愈合也加快。早期适度的炎症因子是机体的重要防御和修复机制^[21]，但持续过度的炎症反应会导致机体损伤，愈合减慢。本研究中的检测时间点为5 d，皮肤缺损模型组出现较明显的持续炎症反应，而Gas6治疗后持续的炎症反应减弱。本实验的不足之处是没有从不同的时间点来观察效应。有研究发现Gas6与其受体Axl结合后参与巨噬细胞极化^[8]，因此Gas6可能也是通过结合其受体Axl调控巨噬细胞极化，发挥伤口修复作用，具体机制有待进一步研究。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突