脓毒症是宿主对于感染的失控而发生的威胁生命的器官功能障碍^[1]。我国每年约有300万例脓毒症患者，死亡人数超过100万人^[2]。脓毒症作为重症监护病房中最常见的一种急危重症，其治疗每延迟1 h，存活率减少7.6%^[3]。对于脓毒症的早期识别有助于规范化治疗的开展和病情控制^[4]。尽管目前脓毒症发生发展的机制尚未完全阐明，但已有研究表明代谢紊乱是其重要的病理生理变化之一^[5]。代谢组学作为系统生物学中的一门学科，主要测量和研究生物样本中内源性小分子物质^[6]。探讨脓毒症早期相关代谢变化，有助于揭示脓毒症的病理生理改变，寻找合适的脓毒症防治策略。本研究基于气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对脓毒症大鼠早期不同时间点血浆进行代谢组学检测，寻找差异代谢物和相关代谢通路的动态变化，从而探索脓毒症早期的病理生理变化规律。

实验动物：8周龄雄性SD大鼠（体质量250~300 g）15只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2015-0013。色谱级甲醇、乙腈购自德国默克公司；L-2-氯-苯丙氨酸、甲氧胺盐酸吡啶、双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷（BSTFA-TMCS）、正己烷购自美国Sigma公司。气相色谱-飞行时间质谱联用仪7890A-5975C为美国Agilent公司产品。

按随机数字表法将大鼠分为假手术组（Sham组，S）6只和脓毒症组（CLP组，C）9只，C组采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型^[7]：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，沿腹部正中线开腹，游离出盲肠后在回盲瓣与盲肠末端的中线处结扎，用18 G针头对穿盲肠2次后将其还纳回腹腔后逐层关腹；S组只游离盲肠，不予以结扎和穿孔，C组和S组术毕后皮下注射5 mL生理盐水补液。本研究中关于动物的处置和操作符合动物实验福利与伦理的基本要求。

造模后2、6和12 h利用硬质毛细玻璃管通过眼眶采血收集相应大鼠血液0.4 mL，收集于EDTA抗凝管，3 000 r/min离心20 min收集血浆，保存于-80 ℃。

取50 μL大鼠血浆加入10 μL的内标（0.3 mg/mL的L-2-氯-苯丙氨酸），加入甲醇/乙腈蛋白沉淀剂150 μL，冰水浴超声提取5 min，15 000 r/min，4 ℃离心10 min，将上清液转移入玻璃衍生瓶，用快速离心浓缩仪挥干；加入80 μL的甲氧胺盐酸吡啶溶液（15 mg/mL），于震荡培养箱中37 ℃肟化反应90 min；取出后再加入80 μL的BSTFA（含1%TMCS）衍生试剂和20 μL的正己烷，涡旋震荡2 min后，于70 ℃反应60 min。取出样本，室温放置30 min，进行GC-MS代谢组学分析。

1 μL衍生化后的提取物通过GC-MS系统分析，样品经非极性的DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm I.D., J & W Scientific, Folsom, CA）分离后进入质谱检测。高纯氦气作为载气，载气流速1.0 mL/min。程序升温：15 ℃/min, 50~125 ℃；5 ℃/min, 125~210℃；10 ℃/min, 210~270℃；20 ℃/min, 270~305℃，305℃维持5 min。进样口温度260℃，EI源温度230℃，电压为-70 V。质量扫描范围（m/z）50~600，延迟5 min开始采集，采集速度为20谱/s。GC-MS工作站软件利用NIST数据库和Feihn代谢组学数据库的标准离子片段谱库比对鉴定内源性代谢物。

GC-MS的原始数据经ChromaTOF软件进行预处理，导出CSV格式的三维数据矩阵，包含样品信息、代谢物信息、保留时间-质核比和质谱响应强度等信息。

通过MetaboAnalyst 4.0（https://www.metaboanalyst.ca/）对数据进行分析，包括主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）模式识别各代谢物的变化，按照P < 0.05、变化倍数绝对值（|fold change|） > 1.5和变量权重值（variable important in projection, VIP） > 1.5筛选相关差异代谢物，并通过KEGG分析差异代谢物所涉及的代谢通路。

PCA模式识别方法对不同时间点大鼠血浆代谢组进行模式判别分析，结果显示2、6和12 h的S组与C组主成分基本集中分布在椭圆形散点置信区间内，表明各个时间点的C组和S组之间存在血浆主成分代谢物的差异。PLS-DA显示各个时间点均呈聚类分布于椭圆形散点置信区间内，表明各个时间点的C组和S组之间存在血浆代谢物的显著差异，PLS-DA模式识别效能优于PCA，见图 1。2、6 h和12 h的C组的PCA和PLS-DA也表明各个时间点间存在血浆代谢物的显著差异，PLS-DA模式识别效能优于PCA，见图 2。

图 1 假手术组和脓毒症组大鼠之间不同时间点PCA和PLS-DA模式识别判别分析 Fig 1 Discriminant analysis of PCA and PLS-DA pattern recognition at different time points between the sham and sepsis groups

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图 2 脓毒症组大鼠不同时间点之间PCA和PLS-DA模式识别判别分析 Fig 2 Discriminant analysis of PCA and PLS-DA pattern recognition between different time points in sepsis rats

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依照t检验P < 0.05、|fold change| > 1.5和VIP > 1.5筛选组间差异代谢物。如表 1所示S2 h组/C2 h组间有14个差异代谢物，其中3, 4-二羟基苯乙醇酸、3-羟基丁酸、3-苯基乳酸、5-氨基戊酸、赤藓糖、半乳糖、葡萄糖酸内酯、葡萄糖、戊二醛、N-氨基甲酰谷氨酸、棕榈酸、核糖醇、蔗糖在脓毒症大鼠2 h血浆中含量降低；腐胺在脓毒症大鼠2 h血浆中含量升高。S6 h组/C6 h组之间有25个差异代谢物，其中1-磷酸葡萄糖、天冬酰胺、N-甲酰基-L-蛋氨酸、丝氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、蛋氨酸、3-氨基异丁酸、葡萄糖、丙氨酸、脯氨酸和5-氨基戊酸在脓毒症大鼠6 h血浆中含量降低；硫辛酰胺、十二烷醇、腐胺、2-脱氧-D-葡萄糖、N-氨基甲酰谷氨酸、糖酸、3-羟基吡啶、花生四烯酸、亚氨基二乙酸、肾上腺素、6-甲基巯基嘌呤、左旋葡聚糖、2-脱氧-D-半乳糖和尿苷在脓毒症大鼠6 h血浆中含量升高。S12 h组/C12 h组之间有21个差异代谢物，亚精胺、N-油烯丙胺、L-别苏氨酸、1-磷酸葡萄糖、肾上腺素、L-谷氨酸、核糖醇、葡萄糖酸内酯、反式-4-羟基-L-脯氨酸、脯氨酸、单油酸甘油酯和5-氨基戊酸在脓毒症大鼠12 h血浆中含量降低；硫辛酰胺、6-羟基己酸二聚体、半乳糖、草酸、吡哆醇、腐胺、3-羟基吡啶、2-羟基戊酸和3-羟基正缬氨酸在脓毒症大鼠12 h血浆中含量升高。绘制差异表达代谢物的热图和VIP评分图，见图 3~4。

A：2 h差异表达代谢物；B：6 h差异表达代谢物；C：12 h差异表达代谢物 图 3 假手术组和脓毒症组大鼠不同时间点差异表达代谢物热图 Fig 3 Heat map of differentially expressed metabolites at different time points in the sham and sepsis groups

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A：2 h差异表达代谢物；B：6 h差异表达代谢物；C：12 h差异表达代谢物 图 4 假手术组和脓毒症组大鼠不同时间点差异表达代谢物VIP评分图 Fig 4 VIP scores of differentially expressed metabolites at different time points in the sham and sepsis groups

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将不同时间点血浆差异代谢物导入MetaboAnalyst 4.0进行信号通路分析。如图 5所示，2 h时差异代谢物相关信号通路分别是淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢；6 h时差异代谢物相关信号通路分别是淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸代谢、花生四烯酸代谢及氨酰tRNA生物合成；12 h时差异代谢物相关信号通路分别是半乳糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢以及维生素B6代谢。

A：2 h差异表达代谢物涉及信号通路；B：6 h差异表达代谢物涉及信号通路；C：12 h差异表达代谢物涉及信号通路 图 5 假手术组和脓毒症组大鼠不同时间点差异表达代谢物涉及信号通路 Fig 5 Differential expression of metabolites involved in signaling pathways at different time points in the sham and sepsis groups

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代谢紊乱是脓毒症发展过程中重要的病理生理变化之一。脓毒症发生后机体的代谢紊乱状态长期存在，使机体迅速陷入负氮平衡状态，体质量下降、免疫功能障碍、重要脏器和组织功能受损，感染率病死率增加^[8]。因此，阐明脓毒症代谢紊乱的发病机制，对于推进相应的治疗措施、改善脓毒症的预后具有重要意义^[9]。

代谢组学的出现为研究整体代谢谱的变化、实现疾病的早期诊断和鉴别、针对性治疗的选择、预后的改善等方面提供新的契机。相较于传统研究方法，代谢组学能够系统全面的反映生物体的代谢特征，从整体层面探讨生命活动的代谢特征和规律^[10]。由于质谱的高灵敏度、高分辨率和高重现性等优势，质谱技术已经被广泛应用于代谢物的鉴定，GC-MS作为代谢组学三大检测分析平台之一，由于其公共数据库定性方便而被广泛应用于研究^[11]。

本研究选择CLP制备脓毒症大鼠模型，该方式是经典的脓毒症模型制备方法，据现有文献报道^[7]及课题组前期研究证实脓毒症大鼠病死率在50%左右，而CLP术后12 h几乎不出现死亡。基于动物伦理的考虑，故课题组仅选用了15只SD大鼠进行连续采血收集。在本研究中，PLS-DA得分图中两组间的样本均聚类分布，说明两组样本血浆代谢物之间存在较为明显的差异。以变化倍数绝对值> 1.5、VIP > 1.5和组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）等条件限定后，C组和S组2 h、6 h和12 h分别检出14个、25个和21个差异代谢物，提示脓毒症早期存在代谢情况的动态变化。进一步挖掘差异代谢物所涉及的代谢通路发现，2 h时间点的代谢通路主要涉及糖类代谢，包括淀粉和蔗糖代谢和半乳糖代谢；随着疾病的进展，6 h时间点的代谢通路除了糖代谢相关通路外，还存在氨基酸代谢的异常，包括精氨酸和脯氨酸代谢、甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸代谢及氨酰tRNA生物合成；而12 h时间点的代谢通路则主要涉及氨基酸代谢相关通路，包括半乳糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。

脓毒症后2 h的差异代谢物除了腐胺增高以外，其他均呈现降低趋势，模型制备后机体呈现出低代谢的状态。本研究脓毒症模型大鼠在造模后表现出一过性的糖代谢相关物质的降低，与脓毒症相关研究中报道的高血糖现象相反^[12-13]，分析原因可能是模型大鼠术前禁食与手术刺激应激产生的糖代谢物质的消耗。除了糖类物质，氨基酸是蛋白质的代谢物，也是蛋白质的合成前体，氨基酸的水平也可以反映脓毒症时机体的能量代谢状况^[14]。氨基酸主要通过三羧酸循环来进行机体内的转化与合成^[15]，脯氨酸代谢、甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸代谢和丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢途径均能进入三羧酸循环参与能量代谢^[16]。一些氨基酸的中间代谢产物即为乙酰辅酶A，或者通过转换形成丙酮酸后经乙酰辅酶A进入三羧酸循环^[17]。三羧酸循环既是分解代谢途径，又能为物质合成提供前体分子。脓毒症早期时机体存在明显的氨基酸代谢紊乱和能量代谢异常^[18]。此外，本研究结果显示，各个时间点的脓毒症组血浆腐胺含量均较假手术组明显升高，与文献报道一致^[19]，腐胺升高可能是由于脓毒症时机体内坏死组织释放、氨基酸降解后生成、肾损伤后腐胺排出减少等原因^[20]。

综上所述，脓毒症大鼠早期血浆代谢物水平呈现显著动态差异，主要是涉及糖代谢和氨基酸代谢。本研究以代谢物层面认识脓毒症发生发展的规律，为深入探讨脓毒症的病理生理学机制奠定了一定的实验基础。

作者贡献声明  蒋宇：酝酿和设计实验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，起草文章，统计分析，获取研究经费；肖雯：实施研究，采集数据，分析/解释数据；陈芳：酝酿和设计实验，对文章的知识性内容作批评性审阅，指导；祝益民：对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突