2 广西壮族自治区妇幼保健院检验科, 南宁 530003;
3 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心重症医学科, 上海 200127
2 Department of Laboratory of Maternal and Child Health Hospital of GuangxiZhuang Autonomous Region Nanning 530003;
3 Department of Intensive Medicine, Shanghai Children'sMedical Center, Affi liated to the Medical College of Shanghai Jiaotong University Shanghai 200127
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是人体糖代谢的重要限速酶类之一,是催化磷酸戊糖途径的第一步反应,可产生还原型辅酶Ⅱ (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)并作为供氢体参与机体多种代谢反应。遗传性G6PD缺乏症是人类最常见的酶缺陷疾病之一,G6PD缺乏患儿因抗氧化能力有限而对病毒、细菌的易感性增高,细菌感染后会出现明显的氧化应激,诱导宿主细胞出现氧化应激,导致细胞结构损伤和功能障碍,通过内在途径触发更强的凋亡活性,从而降低细胞活力[1-3]。
炎症因子是促发和放大脓毒症炎症反应的核心之一,为了研究G6PD患儿细菌感染后炎症因子的临床意义,本研究招募了2014年6月至2017年12月入住广西壮族自治区妇幼保健院PICU细菌感染的G6PD缺乏及无G6PD缺乏患儿,对其入科时、治疗12 h及24 h TNF-α、IL-6、IL-10、CRP水平进行动态监测,同时观察两组脓毒症和MODS发生率、预后、住ICU时间及住院费用进行前瞻性研究。
1 资料与方法 1.1 一般资料前瞻性收集2014年6月至2017年12月符合PICU收治条件入住广西壮族自治区妇幼保健院PICU的细菌感染患儿77例,其中36例G6PD缺乏患儿(观察组)及41例无G6PD缺乏患儿(对照组),入科时全部抽血复检G6PD酶活性以再次确认有无G6PD缺陷,本研究经本院伦理委员会批准(桂妇保院医伦审[2014-2]3-4号)并取得所有患儿家属的知情同意。
1.2 研究方法按前瞻性队列研究方法收集2014年6月至2017年12月入住广西壮族自治区妇幼保健院PICU的患儿,入选标准:(1)满足危重症判断标准,入院24 h内小儿危重病例评分(pediatric critical illness score,PCIS) < 80分;(2)年龄:29 d至14岁,性别不限;(3)病程 < 7 d;(4)细菌感染诊断标准按诸福棠实用儿科学(第八版)上册:细菌感染性疾病诊断标准[4];(5) G6PD缺陷患儿根据新生儿疾病筛查中的G6PD缺乏症筛查诊断及入院复查确诊;(6)住PICU时间>24 h。排除标准:(1)剔除本次发病前存在其他先天性或者后天性基础疾病患儿(G6PD缺陷除外);(2)病程>7 d;(3)近3个月有输血史;(4)住PICU时间 < 24 h或者24 h内死亡患儿;(5)此次病程中入住PICU前有大剂量糖皮质激素使用患儿。患儿入组后,收集以下资料:年龄、性别、PCIS评分、住ICU时间、住院费用、严重脓毒症、脓毒性休克和MODS发生率、治愈好转及死亡情况,以及入科时、治疗后12 h及24 h血TNF-α、IL-6、IL- 10、CRP炎症因子水平。脓毒症诊断标准依据:儿童脓毒性休克(感染性休克)诊治专家共识(2015版)中的严重脓毒症、脓毒性休克诊断标准[5]。
1.3 细胞因子、CRP、G6PD检测及病原学培养鉴定患儿入科时立刻采静脉血检测TNF-α、IL-6、IL-10、CRP及进行血常规、生化、血气分析、凝血功能、G6PD活性及病原学等常规检查。(1)于入科时、治疗后12 h、24 h分别抽静脉血进行复测血清TNF-α、IL-6、IL-10、CRP;(2)细胞因子检测方法为酶联免疫吸附法(ELISA)。仪器为美国伯腾仪器有限公司的biotek酶标仪elx800;试纸盒购自上海西唐生物科技有限公司;(3)CRP采用韩国的i-chroma reader免疫分析仪测定;试剂盒采用韩国的i-chroma reader;(4)复检血G6PD活性定量检测采用北京利德曼生化股份有限公司生产的G6PD试剂盒,检测仪器为美国贝克曼公司的AU5800型多标记分析仪;(5)病原学培养鉴定采用全自动血培养仪BD BACTEC FX和细菌鉴定仪BD Phoenix 100(美国),血平板、麦康凯平板和沙保罗平板由法国梅里埃公司提供。
1.4 G6PD缺乏症筛查后诊断的核实根据新生儿疾病筛查中的G6PD缺乏症筛查诊断及再次复检G6PD活性测定结果确定区分观察组及对照组。其中1例7岁男性患儿家属告知有G6PD缺陷,经过复检G6PD活性测定排除后剔除观察组,可能与当时、当地的检测方法(比值测定法和还原试验检测法可存在2%假阴性或阳性[6])有关。
1.5 统计学方法计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示,计量资料(年龄、儿童重症评分、TNF、IL-6、IL- 10、CRP、住ICU时间及住院费用)两组均数比较采用成组t检验。计数资料(如性别、MODS发生及治疗效果)比较采用χ2检验,两组原发感染部位、病原学标本、细菌培养结果比较采用Fisher确切检验。以 P 0.05为差异有统计学意义。所有数据采用SPSS 11.5统计软件包进行分析。
2 结果 2.1 基本资料两组患儿性别、年龄、pcis、原发感染部位、病原学标本、细菌培养结果见表 1,其中性别、年龄、pcis、原发感染部位、病原学标本、细菌培养结果差异均无统计学意义。
治标 | 观察组 | 对照组 | 统计方法 | P值 |
例数 | 36 | 41 | ||
男 | 31 | 32 | χ2 =0.9476 | 0.3297 |
女 | 5 | 9 | ||
年龄(岁) | 1.75±2.39 | 1.80±2.74 | t=0.0878 | 0.9303 |
PCIS(分) | 73.05±17.34 | 73.05±17.34 | t=0.2725 | 0.7869 |
原发感染部位 | ||||
呼吸系统 | 26 | 32 | χ2 =2.117 | 0.771 |
神经系统 | 3 | 4 | ||
消化系统 | 3 | 4 | ||
循环系统 | 3 | 1 | ||
其他 | 1 | 2 | ||
病原学标本 | ||||
肺泡灌洗液 | 21 | 25 | χ2 =1.743 | 0.863 |
气管内分泌物 | 3 | 5 | ||
血液/骨髓 | 5 | 6 | ||
脑脊液 | 3 | 1 | ||
胸/腹水 | 3 | 3 | ||
其他 | 1 | 1 | ||
细菌培养结果 | ||||
大肠埃希氏菌 | 5 | 4 | χ2 =6.055 | 0.863 |
铜绿假单胞菌 | 1 | 2 | ||
肺炎克雷白菌 | 4 | 3 | ||
鲍曼不动杆菌 | 2 | 3 | ||
流感嗜血杆菌 | 8 | 10 | ||
阴沟肠杆菌 | 1 | 1 | ||
肺炎链球菌 | 8 | 10 | ||
金黄色葡萄球菌 | 4 | 3 | ||
屎肠球菌 | 1 | 0 | ||
化脓性链球菌 | 1 | 2 | ||
无乳链球菌 | 0 | 1 | ||
嗜麦芽窄食单胞菌 | 1 | 0 | ||
李斯特菌 | 0 | 1 | ||
PCIS:小儿危重病例评分(pediatric critical illness score).两组原发感染部位、病原学标本及细菌培养结果比较:使用Fisher确切检验。 |
观察组在入科、治疗12 h和24 h后的TNF-a、IL-6、IL-10和CRP浓度均显著高于对照组血清浓度(表 2),两组比较差异有统计学意义(P 0.05)。但是,两组患儿炎症因子在入科到治疗12 h、治疗12 h到24 h时间段的变化差值,均差异无统计学意义。见表 3。
观察指标 | 观察组(36例) | 对照组(41例) | t值 | P值 |
TNF-α(pg/mL) | ||||
入科时 | 67.74±21.67 | 56.10±13.10 | 2.808 | 0.007 |
12 h | 4.92±22.39 | 62.20±12.66 | 3.010 | 0.004 |
24 h | 65.84±20.75 | 53.22±11.70 | 3.227 | 0.002 |
IL-6(pg/mL) | ||||
入科时 | 100.87±30.63 | 89.08±14.53 | 2.110 | 0.040 |
12 h | 109.88±28.89 | 97.27±14.97 | 2.356 | 0.022 |
24 h | 89.81±22.72 | 77.56±14.67 | 2.768 | 0.008 |
IL-10(pg/mL) | ||||
入科时 | 89.88±22.25 | 78.15±14.93 | 2.693 | 0.009 |
12 h | 97.66±22.37 | 84.68±15.03 | 2.947 | 0.005 |
24 h | 86.74±20.45 | 73.50±13.67 | 3.291 | 0.002 |
CRP(mg/L) | ||||
入科时 | 65.83±48.12 | 25.87±32.36 | 4.215 | 0.000 |
12 h | 77.62±50.36 | 32.57±37.82 | 4.389 | 0.000 |
24 h | 64.11±45.94 | 26.16±34.04 | 4.071 | 0.000 |
观察指标 | 入科到12 h变化差值 | 12 h到24 h变化差值值 |
TNF-α(pg/mL) | ||
对照组(41) | -6.11±3.36 | 8.98±3.87 |
观察组(36) | -7.17±5.86 | 9.08±5.09 |
差值 | -1.063[-3.200, 1.074] | 0.0910[-1.948, 2.130] |
t值 | -0.99 | 0.09 |
修正的P值a | 0.33 | 0.93 |
IL-6(pg/mL) | ||
对照组(41) | -8.19±5.13 | 19.71±3.17 |
观察组(36) | -9.01±6.89 | 20.07±7.84 |
差值 | -0.818[-3.555, 1.919] | 0.362[-2.294, 3.018] |
t值 | 0.55 | 0.79 |
修正的P值a | 0.55 | 0.787 |
IL-10(pg/mL) | ||
对照组(41) | -6.53±4.46 | 11.175±3.132 |
观察组(36) | -7.784±5.36 | 10.925±6.011 |
差值 | -1.254[-3.484, 0.976] | -0.250[-2.389, 1.889] |
t值 | 1.12 | 0.816 |
修正的P值a | 0.266 | 0.816 |
CRP(mg/L) | ||
对照组(41) | -6.699±17.599 | 11.795±17.04 |
观察组(36) | -11.795±17.04 | 13.514±10.125 |
差值 | -5.096[-12.986, 2.794] | 1.719[-4.759, 8.197] |
t值 | 1.287 | 0.529 |
修正的P值a | 0.202 | 0.599 |
注:aP值的修正方法:由于进行了变化趋势的差异比较是基于第一次配对t 检验的结果进行的二次统计比较,因此基于贝叶斯的方法,对于不同组别(对照组和治理组)同一个时间段变化大小的比较进行了 P值的修正。差值的表示的方式为差异的均值和95%的置信区间。 |
观察组患儿较对照组严重脓毒症/脓毒性休克及MODS发生率高,治愈好转率低,未愈及病死率高,两组比较差异具有统计学意义(P 0.05),见表 4。
组别 | n | 严重脓毒症/脓毒性休克 | MODS | 治愈好转 | 未愈死亡 |
观察组 | 36 | 32(88.89) | 29(80.56) | 29(80.06) | 7(19.44) |
对照组 | 41 | 29(70.73) | 24(58.54) | 39(95.12) | 2(4.88) |
χ2值 | 3.8391 | 4.3320 | 3.9403 | 3.9403 | |
P值 | 0.0499 | 0.0373 | 0.0470 | 0.0473 |
观察组与对照组患儿比较:住ICU时间分别为[(7.98±6.55)d和(5.01±6.21) d, t=2.0410, P=0.0448],费用分别为[(36 634.09±11 876.67)元和(31 571.42±10 245.80)元,t=2.0086, P=0.0482],观察组较对照组住ICU时间长和住院费用高,两组比较差异均具有统计学意义(P < 0.05)
3 讨论C6PD缺乏症在全球范围内广泛分布,在我国南方地区发病率较高,尤以广西和广东发病率高,在广西人口中发生率9.96% ~ 14.14%,是广西壮族自治区发病率最高的常见遗传病之一,男性高于女性[7],与本研究的观察组相符(男女比为31:5),男性占86.11%。男性半合子和女性纯合子患者常伴有严重酶缺乏,而女性杂合子患者由于存在X染色体随机失活现象,致使其体内可同时存在G6PD缺陷红细胞和正常红细胞,但上述二者并非平均分布[8]。
G6PD缺乏使细胞内磷酸戊糖代谢受阻,NADPH及GSH生成不足,导致机体抗氧化能力减弱[9],导致宿主易感细菌、病毒等[10-11]。Hsieh等[3]发现G6PD缺陷细胞感染金黄色葡萄球菌后细胞内活性氧显著增加,蛋白印迹法检测到内源性凋亡启动子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9和下游效应子半胱天冬酶-3的高表达,这将通过内在途径触发更强的凋亡活性,从而降低细胞活力。研究发现人冠状病毒、登革热病毒、EV71等病毒感染机体后会释放大量活性氧自由基,使病毒复制增强、DNA受损导致线粒体功能障碍而加重氧化应激损伤[12-13]。Siler等[14]通过检测3例易反复严重感染G6PD缺乏症患儿血液发现其粒细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水平氧化酶功能明显降低,细胞吞噬功能及趋化移动能力降低。Rosa-Borges等[15]通过观察G6PD水平极低的溶血性贫血患者存在严重复发感染,认为在任何出现反复感染的患者中,G6PD应作为慢性肉芽肿性疾病的鉴别诊断。目前研究均提示G6PD患者容易发生细菌和(或)病毒感染,但是,这部分有G6PD基础疾病患儿感染后转归和预后较少报道,通过笔者前瞻性研究发现,G6PD患儿感染后疾病更重、病程更长、预后更差,具体表现在细胞因子和CRP在连续观察的不同时间点,观察组均显著高于对照组。
Wilmanski等[16]提出“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症与脓毒症引起的炎症反应有关”,与野生型小鼠相比,G6PD缺乏型小鼠血清和腹腔液中的白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和IL-10水平在脂多糖(LPS)刺激后均明显升高,说明G6PD缺乏可以使动物细胞因子受炎症刺激后的反应性明显升高或者清除下降,并观察到急性感染小鼠中G6PD缺乏发生脓毒症风险(40%~70%)较非G6PD缺乏(5%~40%)明显增加,MODS发生的风险随之增加,病死率也明显升高。因此研究者认为,G6PD缺乏使动物细胞因子受炎症刺激后的反应性更高,与本研究一致。
机体在急性细菌感染时促炎和抗炎反应相持和交替制衡中,肿瘤坏死因子(TNF-a)是重要的炎性细胞因子,也是炎症反应的最初启动者,能激活细胞因子的级联反应,诱发白细胞介素6 (IL-6)、10 (IL-10)及次级炎症介质的合成如血小板活化因子、前列腺素、一氧化氮和白三烯等,从而导致炎症反应失控,发展为脓毒性休克或MODS,IL-6、IL-10为二级炎症反应介质的主要成分,与脓毒症发生及严重程度有关,当其水平持续升高,提示患者预后不良。CRP是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白,在急性感染6 ~ 12 h后开始升高,其临床意义已被普遍认可。本文G6PD缺乏组TNF-α、IL-6、IL-10、CRP在入科时、治疗12 h及24 h均明显高于非G6PD缺乏组,与温前宽等[17]在成人脓毒症患者中及柳学等[18]在重症脓毒症控制应激性高血糖后观察到的炎症因子变化结果相似。
G6PD缺陷患儿细菌感染时高发炎症综合征引起脓毒症、严重脓毒症及脓毒性休克,继而发生多脏器功能受损甚至衰竭(MODS),严重威胁着儿童及新生儿的生命及生存质量[22]。脓毒症易感性的研究日益受到关注,G6PD缺乏可被认为是新生儿败血症的危险因素,尤其是男性新生儿[1]。本研究发现,急性细菌感染重症G6PD缺陷患儿在各个时间点的细胞因子、CRP浓度均高于无G6PD缺陷患儿,虽然经过相同强度抗炎及脏器功能支持治疗,观察组脓毒症及MODS发生率高,从而导致其住PICU时间长及治疗费用高。提示G6PD缺陷急性细菌感染重症患儿炎症因子浓度更高、病情加重明显、预后差,治疗更困难,其机制可能与氧化应激后,加重了炎症因子的释放,从而引起机体更强的全身炎症反应有关。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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