2020, Vol. 29
2 华中科技大学协和江南医院心血管内科, 武汉 430200;
3 华中科技大学协和江南医院呼吸内科, 武汉 430200;
4 华中科技大学协和东西湖医院信息科, 武汉 430040;
5 华中科技大学同济医学院附属协和医院急诊科, 武汉 430030
2 Department of Vasculocardiology, Xiehe Jiangnan Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430200, China;
3 Department of Respiratory, Xiehe Jiangnan Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430200, China;
4 Department of Information, Xiehe Dongxihu Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430040, China;
5 Department of Emergency, Xiehe Hospital Affiliated to the Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）自2019年12月暴发以来，现已成为中国乃至全球范围内广泛传播的一种新型传染病[1-4]。Yang等[5]的临床研究提示，COVID-19危重症患者病死率高达61.5%，高于重度急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）的病死率（50%）[6]，而目前为止，针对重症COVID-19治疗相关的药物临床试验还非常少，得到的结果与常规治疗相比也并未出现临床状况改善或病死率降低[7]。考虑到康复者体内可能存在抗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）抗体，从而能够针对性地对危重患者进行治疗，本研究团队从2020年1月20日开始使用COVID-19康复者恢复期血浆来救治危重患者，该治疗方法现已取得初步成效。研究提示，某些病毒性疾病的易感性与血型相关，例如：诺如病毒、乙型肝炎病毒[8-10]，亦有研究提示COVID-19患者中具有特殊的血型分布[11]。本研究试图对COVID-19康复者的血型分布进行分析，并对其恢复期血浆抗SARS-CoV-2抗体效价进行检测，同时进一步研究不同血浆抗SARS-CoV-2抗体效价的康复者的ABO血型分布。
1 资料与方法 1.1 捐献血浆康复者的招募 1.1.1 捐献血浆的康复者招募条件捐献血浆的康复者应当同时符合以下条件：依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》确诊为新型冠状病毒肺炎的患者（除外重症、危重症）；距首发症状时间不少于3周；符合《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》中出院标准；年龄18~60岁；出院隔离观察后14 d；男性体质量不低于50 kg，女性体质量不低于45 kg；无其他基础疾病；经临床医师综合患者治疗等有关情况评估可以捐献血浆。本研究中第一批捐赠血浆患者均为武汉市江夏区首批感染的医护人员，在出院前对其进行相关招募工作，明确出院后注意事项，待其隔离期满后准备采血。
1.1.2 捐献血浆者身份的核实捐献血浆者在献血前出示真实有效的身份证件，采集人员进行核对并登记。
1.1.3 捐献血浆者的知情同意捐献血浆前，采集人员参照《血站技术操作规程（2019版）》对捐献血浆者履行书面告知义务，将献血前应告知的内容、捐献血浆目的和数量、可能出现的不良反应及应对措施、联系方式均详细告知捐献血浆者并获取签字后的知情同意书。
1.1.4 捐献血浆的伦理学审批本研究得到了武汉市江夏区第一人民医院医学伦理委员会的批准（批准号:2020-0001）。
1.2 康复者血浆采集方法采用血液成分单采机（XJ-Ⅱ型，重庆三大伟业制药有限公司）采集血浆，每次200~400 mL，血浆采集具体操作同时符合《单采血浆站技术操作规程（2011版）》和《血站技术操作规程（2019版）》相关要求，采集人员现场严密观察捐献血浆者的情况，及时预防和处理捐献血浆者发生的不良反应。将血浆分装成100~200 mL/袋，血浆分装遵循无菌操作的原则。采集或分装的血浆如需长期保存，则快速冷冻至-20℃，并于-20℃以下保存；如保存不超过48 h，可置于2~6℃。
1.3 康复者血浆的安全性和效价的确定遵照《血站技术操作规程（2019版）》相关要求进行常规血液安全性检测。捐献者SARS-CoV-2血液核酸检测结果应当为阴性。SARS-CoV-2血清/血浆IgG抗体[IgG抗体检测试剂盒，96T/盒，武汉科源安博生物技术有限公司（20200213）]经酶联免疫法（MULTSKAN.MK3，芬兰雷勃）定性检测呈反应性且160倍稀释后按照试剂说明书要求检测仍为阳性反应；或SARS-CoV-2血清/血浆总抗体定性检测呈反应性且320倍稀释后按照试剂说明书要求检测仍为阳性反应。同时开展病毒中和试验确定抗体效价。捐献血浆者有妊娠史或输血史的，筛查人类中性粒细胞抗原（human neutrophil antigen, HNA）及人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）抗体。
1.4 康复者血浆的血型检测本研究挑选150例感染SARS-CoV-2的康复期患者，在他们捐赠血浆时进行了血型检查，并参考武汉市近期ABO血型分布调查[11]，另选取来自武汉的180名健康志愿者作为健康对照组。
1.5 统计学方法数据采用SPSS 19.0进行分析。采用卡方检验进行率的比较。当n≥40，且T≥5时，使用Pearson卡方检验。当n≥40，且5>T≥1时，使用连续校正公式。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果A、B、AB、O型血型在健康对照组中的分布约为31.7%、25.0%、9.4%和33.9%；而150例COVID-19康复者中其血型分布约为28.7%、36.0%、9.3%和26%。其中B型血COVID-19康复者数量较健康对照组增多（χ2=4.714，P < 0.05），其余各血型组间分布差异无统计学意义，两组间总体血型分布差异无统计学意义（χ2=5.224，P=0.156），见表 1。
| 组别 | ABO血型 | 总计 | |||
| A | B | AB | O | ||
| 健康对照组 | 57（31.7） | 45（25.0） | 17（9.4） | 61（33.9） | 180 |
| 实验组 | 43（28.7） | 54（36.0） | 14（9.3） | 39（26.0） | 150 |
| χ2值 | 0.349 | 4.714 | 0.001 | 2.411 | |
| P值 | 0.555 | < 0.05 | 0.973 | 0.120 | |
进一步探究性别和年龄这两种因素与COVID-19康复者ABO血型分布的关联性。结果表明在男性和女性康复者组中，其ABO血型分布与健康对照组相比差异无统计学意义，见表 2。
| 组别 | ABO血型 | 总计 | |||
| A | B | AB | O | ||
| 健康对照组 | 57（31.7） | 45（25.0） | 17（9.4） | 61（33.9） | 180 |
| 实验组男性 | 21（27.6） | 28（36.8） | 10（13.2） | 17（22.4） | 76 |
| χ2值 | 0.411 | 3.676 | 0.781 | 3.348 | |
| P值 | 0.522 | 0.055 | 0.377 | 0.067 | |
| 实验组女性 | 22（29.7） | 26（35.1） | 4（5.4） | 22（29.7） | 74 |
| χ2值 | 0.092 | 2.675 | 1.128 | 0.412 | |
| P值 | 0.762 | 0.102 | 0.288 | 0.521 | |
而在三个不同的年龄亚组中，仅在40岁以下组中，B型血COVID-19康复者数量较健康对照组增多（χ2=5.264，P < 0.05），其余年龄亚组中各血型分布组间差异无统计学意义，见表 3。
| 组别 | ABO血型 | 总计 | |||
| A | B | AB | O | ||
| 健康对照组 | 57（31.7） | 45（25.0） | 17（9.4） | 61（33.9） | 180 |
| 40岁以下组 | 27（29.7） | 35（38.5） | 6（6.6） | 23（25.3） | 91 |
| χ2值 | 0.113 | 5.264 | 0.633 | 2.097 | |
| P值 | 0.737 | < 0.05 | 0.426 | 0.148 | |
| 41~50岁组 | 11（23.9） | 13（28.3） | 7（15.2） | 15（32.6） | 46 |
| χ2值 | 1.047 | 0.204 | 0.750 | 0.027 | |
| P值 | 0.306 | 0.651 | 0.386 | 0.870 | |
| 51~60岁组 | 5（38.5） | 6（46.2） | 1（7.7） | 1（7.7） | 13 |
| χ2值 | 0.040 | 1.809 | < 0.01 | 2.709 | |
| P值 | 0.842 | 0.179 | 1.000 | 0.100 | |
本研究同时检测了COVID-19康复者恢复期血浆中和抗体的效价。结果提示94.7%的COVID-19康复者具备较高的中和抗体效价（1:160以上），同时还有5.3%的康复者中和抗体效价≤1:80，见表 4。
| 抗体效价 | 例数 | 百分率 |
| 阴性 | 5 | 3.3 |
| ≤1:8 | 3 | 2.0 |
| ≥1:160 | 6 | 4.0 |
| ≥1:320 | 13 | 8.7 |
| ≥1:640 | 123 | 82.0 |
为了探究COVID-19康复者中是否存在部分血型人群具有相对高的抗体效价，本研究将抗体效价检测中结果为阴性或80倍稀释后按照试剂说明书要求检测为阴性反应的统称为低效价组，而将160、320、640倍稀释后按照试剂说明书要求检测为阳性反应的三组统称为高效价组。对低效价组和高效价组的ABO血型分布分别进行统计，发现相对健康对照组，在高效价组中B型血COVID-19康复者数量较多（χ2=3.979，P < 0.05），而低效价组中各血型组间分布差异无统计学意义，见表 5。
| 组别 | ABO血型 | 总计 | |||
| A | B | AB | O | ||
| 健康对照组 | 57（31.7） | 45（25.0） | 17（9.4） | 61（33.9） | 180 |
| 低效价组 | 3（37.5） | 4（50.0） | 1（12.5） | 0（0） | 8 |
| χ2值 | < 0.01 | 1.356 | < 0.01 | 2.616 | |
| P值 | 1.000 | 0.244 | 1.000 | 0.106 | |
| 高效价组 | 40（28.2） | 50（35.2） | 13（9.2） | 39（27.5） | 142 |
| χ2值 | 0.461 | 3.979 | 0.008 | 1.530 | |
| P值 | 0.497 | < 0.05 | 0.929 | 0.216 | |
| 注：低效价组为阴性组+≤1:80；高效价组为≥1:160+≥1:320+≥1:640 | |||||
COVID-19是以新型冠状病毒肺炎为主要表现的暴发性传染性疾病[12]。近期研究提示，年龄、性别、血型分布与COVID-19疾病易感性有关，其中老龄及男性COVID-19患者较易进展为重症，同时A型血人群易感性增加，O型血人群易感性降低[3, 11]。本研究对COVID-19康复者血型进行了分析，结果提示40岁以下B型血人群数量相对较多。进一步对康复者进行抗体效价检测时发现，5.3%的康复者血浆抗SARS-CoV-2抗体效价较低，不适于作为COVID-19恢复期血浆捐献对象；而其余94.7%的血浆SARS-CoV-2抗体效价较高的康复者中，仍以B型血人群数量较多，提示B型血COVID-19康复者可能更适宜作为COVID-19恢复期血浆捐献对象。
COVID-19与重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome, SARS）在病毒结构上具有79%同源性[12]，不仅在症状上表现出相似性（如发热、咳嗽、肌痛、疲劳）[2]，在易感人群的血型分布上也均表现出O型人群易感性较低的特点[10]。Guillon等[13]发现抗A抗体可以特异性抑制SARS-CoV S蛋白表达细胞与ACE2表达细胞的结合。而刘良教授团队在COVID-19患者的尸检中也发现，SARS-CoV-2可以攻击具有ACE2受体的器官，如肺脏、心脏、肝脏、肾脏和消化道肠壁等[14]。鉴于SARS-CoV和SARS-CoV-2结构上高度的相似性，COVID-19 B型血康复者是否因为血浆中含有抗A抗体而具有相对高的治愈率，而同样具有抗A抗体的O型血患者为何治愈率不及B型血患者仍需要进一步研究。由于本研究中入组康复者数量有限，人群的选择上不可避免存在一定程度的偏倚。若要得到更为可靠的结论仍需更大规模的人群调查研究。
病毒感染性疾病（如H1N1、流行性出血热）康复后常会出现抗体缺失的情况[15-16]，本研究中亦发现少数康复者血浆抗体效价较低或缺失。考虑到血浆治疗中出现炎症风暴的可能，本研究在捐献者的选取中排除了危重型COVID-19康复患者，这可能使得入选者中包含了接触病毒含量较低的康复者，从而使得免疫过程中产生的抗体效价也较低。同时，患者抗体效价高低随病程长短而变化，但由于临床上目前对于COVID-19潜伏期长短还存在争议（0~24 d）[17]，因此很难判断患者具体的致病时间，将在后续的研究中持续关注这一问题。另外免疫耐受、先天性受体缺乏等过程也可能造成康复者的抗体缺失。其具体机制仍有待进一步证实。
综上所述，本研究发现了COVID-19康复者中特殊的ABO血型分布。其中，40岁以下B型血康复者数量较多，更适宜作为COVID-19恢复期血浆捐献对象。而有少部分的康复者血浆抗SARS-CoV-2抗体效价较低，不适于作为COVID-19恢复期血浆捐献对象。
作者贡献声明 段凯：负责实验设计和数据采集；
肖笛：负责数据分析、文章撰写和修改；
胡芬：负责康复者血浆采集工作；
吴鹏：负责数据采集；
刘本德：负责整体课题规划、文章撰写和修改；
段凯、肖笛、胡芬、吴鹏为共同第一作者
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
临床试验注册:ChiCTR2000030046
Trial registration: ChiCTR2000030046
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