2020, Vol. 29
2 湖北医药学院附属东风总医院妇产科 十堰 442000
心脏骤停后综合征(post-cardiac arrest syndrome, PCAS)是心肺复苏后由于缺血-再灌注损伤引起的全身多器官功能障碍，其病理生理学基础是缺血后导致的全身炎性反应[1]。如何抑制PCAS的炎性反应成为治疗的关键。心肺脑复苏后脑功能障碍最难恢复，目前公认的PCAS脑保护的有效治疗仍是亚低温[2]，开发有效的神经保护剂应用于PCAS脑保护治疗成为心肺复苏研究的热点。尤瑞克林（urinary kallidinogenase, UK）主要成分为人尿激肽原酶，能选择性扩张脑缺血部位细小动脉，增加缺血脑组织血流量，促进缺血区新生血管生成，减轻炎症反应，其机制与抑制缺血区细胞凋亡有关[3-4]。本研究拟研究尤瑞克林对PCAS后脑炎性因子的影响及可能机制，为UK在PCAS中脑保护的应用提供依据。
1.1 材料与方法 1.1.1 动物与分组所有动物实验遵照1996版《美国实验动物使用指引》 (NIH Publication No：80-23)要求，获得湖北医药学院动物伦理委员会的批准。48只日本大耳白兔由湖北省实验动物研究中心提供，6月龄，雄性，平均体质量（2.29±0.18）kg。随机数字法分为4组：①sham组；②PCAS组；③UK大剂量组（high-dose group, UK-H）；④UK小剂量组（low-dose group, UK-L）。
1.1.2 主要设备飞利浦心电监护仪，有创动脉血压压力转换器，小动物呼吸机（瑞沃德生命科技有限公司，11012VMR），24号留置针，新生儿气管插管、导尿管及胃管，净化工作台、离心机。
1.1.3 主要试剂尤瑞克林（0.15PNAU/瓶，广东天普生化医药股份有限公司）、ELISA试剂盒(武汉博士德公司)、定量PCR试剂盒（美国MBI公司），Caspase-9、NF-κB等抗体（美国杰美基因公司）、司可林、速眠新、肾上腺素、苏3号、5%碳酸氢钠、多聚甲醛等。
1.2 方法 1.2.1 模型建立气管夹闭窒息法制备PCAS动物模型[5]：速眠新0.24 mL/kg麻醉后固定，行心电监护，24号留置针穿刺股动脉，飞利浦监护仪监测血压和心率。逆行气管插管，固定气管导管。sham组仅麻醉和插管，PCAS组和尤瑞克林组经耳缘静脉静注司可林（1 mg/kg），夹闭气管导管至心搏骤停。以动脉血压失去波动呈一条直线或平均动脉压 < 18 mmHg作为心脏骤停的判断标准。心搏停止5 min后进行复苏，行人工胸外心脏按压，频率180~220次/min（按压频率采用节拍器控制），同时呼吸机辅助呼吸（频率35次/min，潮气量10 mL/kg，气道压力0~1 cmH2O），静注肾上腺素0.25 mg/kg，1次/3 min；5%碳酸氢钠2 mL/kg，1次/30 min，连续4次；陆醒灵肌注0.24 mL/kg。复苏成功标准：心肺复苏持续10 min，动物恢复自主循环（ROSC）持续10 min以上。注射用尤瑞克林以灭菌生理盐水稀释，复苏成功后大、小剂量立即经耳缘静脉给予17.5×10-3PNAU/kg、3.5×10-3PNAU/kg，1次/d；PCAS组注射同等剂量生理盐水[6]。
1.2.2 炎性因子检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。
1.2.3 免疫组织化学检测复苏成功后48 h麻醉处死动物，先用200 mL生理盐水快速冲洗，然后用4℃ 4%多聚甲醛500 mL继续灌注内固定至少1.5 h。每组随机（随机数字法）选5只家兔，断头取脑，包埋成蜡片，免疫组织化学染色后，高倍镜下观察脑组织中IL-1、IL-6阳性细胞数。
1.2.4 Caspase-9、P-Akt、NF-κB表达检测每组剩余5只，迅速剥离颅骨取出脑组织至于冰器皿上，分离出大脑皮层，置于液氮罐冻存。检测前先将脑组织称质量，约100 mg，常规方法提取脑组织蛋白，8%SDS-PAGE电泳后转膜和封闭。分别加入相应一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗孵育30 min，DAB显色；37℃PBS终止显色、照像。结果用分析软件Image J处理，β-Actin为内参照对比，分析目标条带的光密度值，比值结果表示其蛋白相对含量。
1.3 统计学方法采用SPSS 18.0进行数据分析，所有指标，符合正态性的计量资料均采用单因素方差分析Dunnett-t检验，以均数±标准差表示（Mean±SD），P < 0.05有统计学意义。
2 结果 2.1 基本情况各组家兔基本生理学质量、手术操作时间、48h存活情况见表 1。
| 组别 | 数量 （n, 只） |
体质量 （kg） |
手术操作时间 （min） |
48hROSC存活情况 （只） |
| Sham组 | n=12 | 2.21±0.19 | 15±4 | 12 |
| PCAS组 | n=12 | 2.32±0.22 | 82±12 | 10 |
| UK-L组 | n=12 | 2.29±0.19 | 78±13 | 11 |
| UK-H组 | n=12 | 2.24±0.18 | 81±12 | 10 |
PCAS组、UK-H组、UK-L组血清IL-1、IL-6、TNF-α水平在复苏后48 h较sham组均明显升高（P < 0.05）；UK-H组、UK-L组在复苏后48 h与PCAS组比血清IL-1、IL-6、TNF-α升高水平明显减少（P < 0.05）；且UK-H组减少更为明显（P < 0.05）（见表 2）。
| 组别 | 数量 | IL-1 | IL-6 | TNF-α |
| Sham组 | n=12 | 0.12±0.04 | 0.09±0.03 | 20.23±2.47 |
| PCAS组 | n=10 | 0.28±0.06a | 0.29±0.07a | 41.58±6.34a |
| UK-L组 | n=11 | 0.22±0.05ab | 0.21±0.06ab | 32.07±5.21ab |
| UK-H组 | n=10 | 0.17±0.04abc | 0.15±0.03abc | 24.03±4.24abc |
| 注：与假手术组比较，aP < 0.05；#与PCAS组比较, bP < 0.05；与UK-L组比较, cP < 0.05 | ||||
与sham组相比，PCAS组、UK-H组、UK-L组，IL-1、IL-6高倍镜下阳性细胞数明显增多（P < 0.05），UK-H组、UK-L组与PCAS组比IL-1、IL-6高倍镜下阳性细胞数显著降低（P < 0.05）；且UK-H组与UK-L组比降低更为明显（P < 0.05），见表 3。
| 组别 | 数量 | IL-1阳性 细胞数 |
IL-6阳性 细胞数 |
| （只） | （个/高倍镜） | （个/高倍镜） | |
| Sham组 | n=5 | 3.39±0.31 | 2.35±0.42 |
| PCAS组 | n=5 | 29.06±3.34a | 26.73±4.12a |
| UK-L组 | n=5 | 20.51±2.98ab | 19.25±2.64ab |
| UK-H组 | n=5 | 12.17±2.04abc | 10.89±2.16abc |
| 注：与假手术组比较，aP < 0.05；#与PCAS组比较, bP < 0.05；与UK-L组比较, cP < 0.05 | |||
sham组、PCAS组、UK-H组、UK-L组Caspase-9、P-Akt、NF-κB蛋白表达（见图 1）。引入Actin为内参定量分析显示（见图 2）：PCAS组、UK-H组、UK-L组较sham组比，NF-κB、Caspase-9显著增加；UK-H组、UK-L组与PCAS组相比，NF-κB、Caspase-9表达显著降低（P < 0.05），且UK-H组较UK-L组明显（P < 0.05）。与sham组比，P-Akt在PCAS组表达升高；与PCAS组相比，P-Akt在UK-H组、UK-L组表达显著升高（P < 0.05），且UK-H组表达更为明显（P < 0.05）。
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| 图 1 各组Caspase-9、P-Akt、NF-κB表达 |
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| a与假手术组比较, P < 0.05; b与PCAS组比较, P < 0.05; c与UK-L组比较, P < 0.05 图 2 各组Caspase-9、P-Akt、NF-κB表达定量分析 |
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心肺脑复苏过程实质上是全身组织缺血-再灌注的过程，可促进多种炎症介质释放，导致器官功能障碍或衰竭[7]，其中脑功能障碍恢复难度最大，严重影响PCAS患者的预后。脑缺血再灌注损伤会引起脑组织局部大量炎性细胞和炎性因子聚集，是造成脑再灌注损伤主要原因之一[8]。炎性反应的标志是白细胞浸润，其中白细胞介素(interleukin，IL) 1、IL-6及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)是重要的细胞炎性因子[9-10]。
注射用尤瑞克林是一种从人的尿液中提取的人组织型激肽原酶，是激肽释放酶-激肽系统的一个正向调节物质，能分解产生血管缓激肽和血管舒张素，在脑缺血时发挥减少脑梗死体积、改善神经功能损伤等作用[11]。其机制可能与UK抑制氧化应激，减少细胞炎性反应，减少Caspase-3及NF-κB表达等有关[12-13]。
本研究发现，与PCAS组相比，药物干预组血清IL-1、IL-6、TNF-α升高水平明显减少，脑组织IL-1、IL-6含量明显减低，说明尤瑞克林能够抑制CPR后脑损伤炎性反应，推测其对PCAS有脑保护作用。
Caspase-9[14]属于半胱氨酸蛋白酶家族成员，参与启动并执行凋亡程序。缺血性脑损伤时，细胞内外各死亡信号激活Caspase-9引起细胞凋亡[15]，神经保护剂可抑制其表达[16]。NF-κB是一种具有多向性转录激活功能的调节因子，其主要是参与免疫、炎症、细胞凋亡等生理和病理过程中的基因表达调控[17]。Akt是分子质量约57 kDa的丝/苏氨酸蛋白激酶，Akt信号转导途径作为引起细胞凋亡的外源性途径之一，通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase -9、NF-κB、Mdm-2表达，是重要的抗凋亡调节因子。本研究发现，ROSC48h后UK干预组P-Akt表达明显升高，Caspase-9、NF-κB表达水平明显降低，推测UK可能通过激活Akt途径，抑制Caspase-9、NF-κB表达发挥脑保护作用。本研究同时观测到，与UK-L组比，UK-H组ROSC后48 h各检测指标便化更为显著，推测UK对PCAS后脑保护作用存在剂量依赖性。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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