中华急诊医学杂志  2020, Vol. 29 Issue (3): 372-376   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2020.03.014
还原型谷胱甘肽治疗双硫仑样反应的实验研究
唐代彬1 , 严秀芳1 , 李聚学2 , 朱小空1 , 周靖平2 , 戴青松1 , 朱平1     
1 南京医科大学附属逸夫医院急诊科 211166;
2 南京医科大学基础医学院生物化学系 211166
摘要: 目的 建立双硫仑样反应(disulfiram-like reaction,DLR)小鼠模型,观察还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)对该模型血清乙醇及其产物乙醛水平的影响。方法 雄性C57BL/6小鼠35只,用随机数字表法随机分为模型组(M组,n=21)和对照组(S组,n=14),分别给予拉氧头孢溶液(M组:10 mg/mL,0.02 mL/g)和生理盐水(S组:0.02 mL/g)定时腹腔注射,每日一次,共2 d;于末次注射后1 h给予乙醇溶液(20% v/v, 0.01 mL/g)灌胃;此后20 min自眶静脉采血50 μL。建模后M组随机分为3个亚组,每组7只,于乙醇灌胃后30 min分别给予5%葡萄糖(GS组)、地塞米松/维生素C(DC组)及GSH溶液(RG组)腹腔注射(0.01 mL/g);其后0.5、1、1.5和2 h分别自眶静脉采血50 μL,留取血清标本后用气相色谱法检测乙醇及乙醛的含量。两组数据用独立样本t检验分析,M组3个亚组计量资料用单因素方差分析,3组样本均数多重比较用Dunnett-t检验分析。结果 M组血清乙醛水平(2.96±0.52)mg/100 mL高于S组(2.07±0.22)mg/100 mL,差异有统计学意义(t=6.096,P < 0.01)。GS及DC两组乙醇及乙醛水平差异在干预后不同时点均无统计学意义(P > 0.05)。与GS及DC两组比较,RG组乙醛及乙醇水平于干预前(0 h)差异无统计学意义;干预后各时点乙醛水平差异均有统计学意义(0.5 h,P < 0.05;1 h、1.5 h和2 h,P < 0.01)。RG组乙醇水平与GS组比较,于干预后各时点差异均有统计学意义(1 h,P < 0.01;0.5 h、1.5 h、2 h,P < 0.05);与DC组比较,于干预后1 h及1.5 h差异均有统计学意义(1 h,P < 0.01;1.5 h,P < 0.05), 于0.5 h及2 h差异无统计学意义(P > 0.05)。结论 GSH可促进乙醛及乙醇的代谢,降低C57BL/6小鼠血清乙醛和乙醇水平,可作为治疗DLR的有效解毒剂。
关键词: 还原型谷胱甘肽    双硫仑样反应    乙醇/乙醛测定    气相色谱法    实验研究    C57BL/6小鼠    

双硫仑样反应(disulfiram-like reaction,DLR)是急诊科常见急症之一,其临床表现不一,程度轻重不同,轻者可表现为恶心、呕吐、腹痛、潮红、心动过速、搏动性头痛或晕厥,严重者可出现呼吸抑制、循环衰竭、心律失常、抽搐和死亡[1],有报道称其病死率可达6.4%[2]。DLR的急救措施包括吸氧、补液及对症治疗,目前尚无迅速有效的解毒药物被推荐应用。笔者在临床实践中观察发现,还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)静脉滴注治疗DLR,常在给药后10~30 min内迅速缓解症状;有研究在使用糖皮质激素、抗组胺药物的基础上加用GSH治疗DLR时发现,试验组疗效显著优于一般治疗组[3]。然而,GSH治疗DLR的机制尚不明确,本研究通过建立小鼠DLR模型,并测定不同干预条件下血清乙醇及乙醛含量的变化,观察GSH对乙醇及乙醛代谢的影响,以探讨GSH治疗DLR的机制,为临床推广应用提供实验证据。

1 材料与方法 1.1 实验动物分组

实验于南京医科大学基础医学院生物化学系李聚学实验室实施,采用8周龄、健康、清洁级雄性C57BL/6小鼠,共35只,由南京医科大学实验动物中心提供,预先编号、称重并登记。采用随机数字表法分组,于建模阶段将小鼠分为模型组(M组,n=21)及对照组(S组,n=14)。建模成功后,于试验阶段再将M组随机分为三个亚组,每组7只,分别为5%葡萄糖对照组(GS组),地塞米松/维生素C对照组(DC组)和GSH组(RG组)。

1.2 方法 1.2.1 实验试剂配制

① 拉氧头孢溶液:注射用拉氧头孢0.5 g(浙江惠迪森药业)加生理盐水50 mL,配制成10.0 mg/mL溶液;②乙醇溶液:分析纯乙醇10 mL,加蒸馏水40 mL,配制成20%(v/v)乙醇溶液;③GSH溶液:GSH 0.9 g(上海复旦复华药业),加入5%葡萄糖注射液125 mL,配制成7.2 mg/mL溶液;④地塞米松/维生素C溶液:地塞米松注射液5 mg(辰欣药业),维生素C注射液1 g(上海信谊金朱药业),加入5%葡萄糖注射液125 mL。以上试剂均于实验时现配。⑤乙醇标准储备液:准确移取乙醇标准品(上海西宝生物公司)127 μL(0.1 g),用水稀释并定容至10 mL,配制成10.0 mg/mL乙醇标准储备液。4℃保存。⑥乙醛标准储备液:准确移取乙醛(上海西宝生物公司)13 μL(0.01 g),用水稀释并定容至10 mL,配制成1.0 mg/mL乙醛标准溶液。4℃保存。⑦仲丁醇标准溶液:准确移取仲丁醇(上海西宝生物公司)62 μL(0.05 g),用水稀释并定容至100 mL,配制成0.5 mg/mL仲丁醇标准溶液。4℃保存。

1.2.2 实验步骤及干预措施

⑴建立DLR动物模型:M组和S组小鼠分别给予拉氧头孢溶液和生理盐水,按0.02 mL/g的用量腹腔注射,每日定时给药1次,共2 d。两组小鼠均于末次腹腔注射后1 h以乙醇溶液按0.01 mL/g的用量灌胃,并于乙醇灌胃后20 min经眶静脉采血50 µL。基于先期预实验结果,以小鼠血清乙醛水平显著高于对照组为建模成功。

⑵分组干预方法:M组小鼠于乙醇灌胃后30 min按亚组分组的不同给予不同干预措施,即GS组给予5%葡萄糖溶液,DC组给予地塞米松/维生素C溶液,RG组给予GSH溶液,均按0.01 mL/g的用量分别腹腔注射。各组小鼠分别于腹腔注射干预后0.5、1、1.5和2 h采取眶静脉血,每次50 µL;于末次采血后以颈椎脱臼法处死小鼠。血液标本于4℃冷藏静置,凝血后用Microfuge 20 R型高速冷冻离心机以3 000 g离心力超速离心30 min后取血清20 µL以备检测乙醇及乙醛浓度。

1.2.3 检测方法

⑴样品处理:取0.01 mL待测血样和0.01 mL仲丁醇标准溶液,加入样品瓶(容积1.5 mL)中,混匀。置于恒温加热器中,70 ℃加热15 min,吸取顶空瓶内气体0.10 mL,用美国赛默飞世尔气相色谱仪、配火焰离子化检测器进行气相色谱仪分析。各样品乙醇、乙醛浓度分别以各自峰面积用标准乙醇、乙醛与仲丁醇浓度峰面积回归方程计算。

⑵色谱条件:色谱柱为PEG 20M (30 cm×0.25 mm×0.25 µm);柱温60℃;检测器温度230 ℃;进样口温度180℃;载气流速1.5 mL/min;分流比1︰20。

⑶工作曲线绘制:分别吸取10.0 mg/mL乙醇和1.0 mg/mL乙醛标准储备液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中,用蒸馏水定容,分别配成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL乙醇标准系列溶液及0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL乙醛标准系列溶液。吸取各标准系列溶液0.01 mL于样品瓶中,各加入0.01 mL仲丁醇标准溶液,置恒温加热器中70 ℃加热15 min后,用气相色谱仪分析。以各管乙醇、乙醛与仲丁醇峰面积比对乙醇、乙醛浓度进行线性回归,求回归方程。

1.3 统计学方法

用SPSS 21.0软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示,各组数据均经正态检验和方差齐性检验;建模阶段两组计量资料的比较用两组独立样本t检验;试验阶段各亚组计量资料采用单因素方差分析(one-way ANOVA),三组样本均数多重比较采用Dunnett-t检验进行分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 小鼠DLR表现

乙醇灌胃15 min后,S组小鼠呼吸轻度加快,活动性无明显改变或稍减少,对袭扰存在防护性攻击行为。M组小鼠呼吸明显加快,活动性明显减少,行走缓慢并出现明显共济失调,或出现静止震颤,对袭扰无防护性攻击行为。

2.2 小鼠血清乙醇及乙醛水平变化

两组小鼠的体质量及乙醇灌胃后20 min血清乙醇及乙醛水平见表 1。采用单样本K-S正态性检验显示,两组样本各数值均呈正态分布;方差齐性检验显示两组数值方差齐性;两组小鼠体质量及血清乙醇水平差异无统计学意义(P > 0.05);M组血清乙醛水平高于S组,差异有统计学意义(t=6.096,P < 0.01)。两组小鼠血清乙醛及乙醇气相色谱图见图 1

表 1 两组小鼠体质量及乙醇灌胃后20 min血清乙醇和乙醛水平比较(Mean±SD)
组别 只数 体质量(g) 乙醛浓度
(mg/100 mL)
乙醇浓度
(mg/100 mL)
S组 14 26.22±1.66 2.07±0.22 203.05±55.36
M组 21 25.70±1.61 2.96±0.52 235.19±73.61
t -0.920 6.096a 1.390
P 0.364 < 0.01 0.174
注:aP < 0.01;M组,模型组;S组,对照组

图 1 M组和S组小鼠血清乙醇及乙醛气相色谱图
2.3 不同干预措施对DLR小鼠血清乙醛及乙醇水平的影响

单样本K-S正态性检验显示,建模后三亚组样本不同时点数值均呈正态分布(P > 0.05);方差齐性检验示各组数值均方差齐性。方差分析显示干预前(乙醇灌胃后20 min,0 h)各组间乙醛及乙醇水平差异无统计学意义(P > 0.05);干预后各样本均数间两两比较分析显示,GS及DC组在不同时点乙醇及乙醛水平差异无统计学意义(P > 0.05);与GS及DC比较,RG组乙醛水平于干预后降低,各时点差异均有统计学意义(0.5 h,P < 0.05;1、1.5、2 h,P < 0.01);与GS组比较,RG组乙醇水平于干预后降低,各时点差异均有统计学意义(0.5、1.5、2 h,P < 0.05;1 h,P < 0.01);与DC比较,RG组乙醇水平于干预后1 h、1.5 h显著降低,差异有统计学意义(1 h,P < 0.01;1.5 h,P < 0.05),于0.5 h、2 h差异无统计学意义(P > 0.05),见表 2。RG组干预前及RG、DC组干预后0.5 h标本气相色谱图见图 2

表 2 干预前及干预后不同时间点各组血清乙醛及乙醇水平比较(Mean±SD,mg/100 mL)
检测项目 组别 只数
n
干预前
(0 h)
干预后
0.5 h 1 h 1.5 h 2 h
乙醛水平
GS组 7 2.94±0.54 2.76±0.40 2.58±0.18 2.31±0.61 2.10±0.30
DC组 7 2.84±0.48 2.83±0.34 2.69±0.12 2.49±0.26 2.11±0.15
RG组 7 3.11±0.56 2.22±0.40ac 1.79±0.19bd 1.73±0.25bd 1.66±0.2bd
F 0.488 5.431 59.724 6.632 7.857
P 0.622 0.014 < 0.01 0.007 0.004
乙醇水平
GS组 7 228.64±74.88 168.08±29.25 146.31±23.66 90.82±29.41 71.75±31.07
DC组 7 229.93±57.13 155.69±47.47 129.35±28.33 94.47±41.49 61.85±10.35
RG组 7 247.01±94.58 122.52±15.31a 71.13±13.05bd 54.58±13.58ac 44.54±13.15a
F 0.124 3.486 21.299 3.687 3.198
P 0.884 0.053 < 0.01 0.046 0.065
注:为各组间乙醛水平及乙醇水平同质比较;Dunnett-t检验,与GS组比较,aP < 0.05,bP < 0.01;与DC组比较,cP < 0.05,dP < 0.01。GS,5%葡萄糖动物对照组;DC,地塞米松/维生素C动物对照组;RG,还原型谷胱甘肽动物试验组

A:RG组干预前;B:RG组干预后0.5 h;C:DC组干预后0.5 h;RG组:还原型谷胱甘肽治疗组,DC组:地塞米松/维生素C治疗对照组 图 2 小鼠血清乙醇及乙醛气相色谱图
2.4 干预后小鼠活动能力的变化

干预后1 h观察各组小鼠活动状况,RG组小鼠较GS组及DC组呼吸频率及幅度减低,探寻活动增多,对袭扰出现逃避行为。

3 讨论

双硫仑是一种乙醛脱氢酶抑制剂,摄入该药后饮酒,人体可出现严重不适。某些处方药具有与双硫仑类似的性质,在体内可抑制乙醛脱氢酶活性,用药后即便摄入少量乙醇,机体也可产生程度不同的不良反应[1],即DLR。DLR的报道国内常见,多由于短时间内相继摄入乙醇饮料和致DLR药物所致,此外尚可见使用含乙醇药物导致的药源性病例。国外有患儿服用含5%乙醇的泼尼松龙口服液后静脉滴注头孢曲松出现DLR的报道[4],Alonzo也报道了使用甲硝唑后口服含30%乙醇的浓泼尼松溶液后出现DLR的病例[1]。由此可见,DLR在临床上并非少见,对DLR治疗药物的探索具有现实意义。

DLR出现多系统损害的机制在于致DLR药物抑制了体内的乙醛脱氢酶,机体摄入乙醇后出现乙醛蓄积[5]。乙醛是乙醇在乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)或细胞色素P4502E1(CYP2E1)催化脱氢氧化的代谢产物,其毒性较强。一方面,乙醛通过消耗抗氧化剂或通过氧化作用生成自由基促进氧化应激[6],其机制在于乙醛可引起线粒体功能紊乱,从而干扰氧化磷酸化及电子传递过程,导致细胞内氧化应激反应,活性氧簇水平上升[7]。另一方面,由于乙醛化学性质活泼,能与体内各种蛋白质或膜物质结合,形成乙醛-蛋白质加合物,从而干扰多种酶的催化性质,影响细胞内多种代谢途径和生物膜的完整性[8]。Tsukamoto和Lu[6]认为上述两种效应相互促进,氧化应激和脂质过氧化醛产物的存在可促进乙醛蛋白加合物的形成;反之,乙醛蛋白加合物形成后又可加重氧化应激,因为脂质过氧化终产物丙二醛形成后,可使乙醛与大分子的结合力增加13倍。例如,乙醛通过与细胞的结构或功能蛋白共价结合而引起肝损伤,同时通过消耗GSH促进氧化应激。此外,乙醛在体内可干扰能量代谢,影响神经信息传递。Liu等[9]采用气相色谱-质谱(GC-MS)法检测拉氧头孢诱导DLR大鼠模型代谢组学的变化发现,在90种确定的代谢物中,血浆和脑脊液中分别有45和43种物质含量的变化有统计学意义。

研究也表明,乙醛的毒性作用是DLR出现循环系统表现的病理生理学机制。Bae等[10]发现乙醛脱氢酶缺陷ALDH2*1/2基因型受试者摄取乙醇后面部潮红度及脉率显著升高,与血乙醛浓度显著相关。Oba等[11]发现,乙醛可使大鼠乳头肌或心室肌细胞出现负性肌力效应,同时肌膜电压依赖性L-型Ca2+通道活性下降,细胞内Ca2+转运受到抑制,Purkje纤维动作电位时程延长。有研究报道,以5~10 mg/kg的剂量静脉注射乙醛10~13 s后,氟烷麻醉猫可出现严重室性心律失常[12],DLR导致猝死的机制可能与上述发现相关。因此,对DLR的治疗应从促进乙醛代谢、降低血乙醛水平和拮抗乙醛毒性着手。

目前临床上对DLR的治疗药物尚未有共识,常用的药物包括糖皮质激素、纳洛酮及水溶性维生素类药物[13]等,也见使用生脉注射液、醒脑静、葛根素、三磷酸胞苷二钠等治疗DLR的报道[14],其中以地塞米松和维生素C两者联用的报道较多。然而,DLR不是过敏反应,与乙醇本身的毒性作用也无关,上述药物均未涉及降低乙醛水平、拮抗乙醛毒性的作用机制。Elenbaas[15]认为铁盐、维生素C、抗组胺类药物及吩噻嗪类药物对DLR均无确切疗效。本实验结果证实,维生素C和地塞米松两者联用并不能降低小鼠血清乙醛的含量,其在临床中的效应可能与地塞米松的膜稳定作用有关;有研究提示,维生素C和地塞米松可能通过降低血管内皮细胞通透性而减轻DLR的症状[16]。本实验显示,GSH可促进DLR小鼠血清乙醛及乙醇水平降低,提示GSH可作为DLR治疗的推荐用药。

GSH治疗DLR的机制可能与其直接参与乙醛代谢,降低血乙醛和乙醇水平,清除自由基,抗氧化,恢复蛋白质和酶的功能和活性,保护和恢复生物膜功能有关。GSH(N-L-G-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酸)是一种由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成的三肽,其结构中含有一个活泼的巯基(-SH),在氧化应激条件下可转化为氧化形式,又可通过谷胱甘肽还原酶的作用还原为还原形式[17]。因此,GSH是体内一种重要的抗氧化剂,它可清除体内自由基,保护体内蛋白质和酶等分子中的巯基[18]。也有研究表明,体内乙醛可与半胱氨酸和(或)谷胱甘肽结合,细胞内游离谷胱甘肽水平降低[19],提示GSH可能直接参与乙醛的代谢;某些醛类可与GSH反应生成硫代半缩醛,有研究者以甲醛为例描述了这一反应过程,甲醛可与GSH发生自发反应,形成S-羟甲基谷胱甘肽,随后被胞浆甲醛脱氢酶氧化,将两个电子转移至辅酶Ⅰ(NAD+)后形成甲酰谷胱甘肽[20]。此外,GSH还可以非酶的方式将乙醛分子限制于其分子内,一分子GSH最多可限制4分子乙醛[21]

本研究用C57BL/6小鼠制作DLR动物模型,该小鼠嗜酒性强,肝脏中醇脱氢酶活性极高。实验证实,该品系小鼠在给予拉氧头孢注射后再行乙醇灌胃,体内乙醛水平显著高于对照组。该模型易于复制,对乙醇耐受性强,病死率低,可用于DLR的研究。本研究发现常用剂量GSH可促进乙醇和乙醛的代谢。然而,本实验尚未揭示乙醛代谢的速率是否与GSH的剂量有关,有待进一步研究。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献
[1] Alonzo MM, Lewis TV, Miller JL. Disulfiram-like reaction with metronidazole: an unsuspected culprit[J]. J Pediatr pharmacol ther, 2019, 24(5): 445-449. DOI:10.5863/1551-6776-24.5.445
[2] Ren S, Cao Y, Zhang X, et al. Cephalosporin induced disulfiram-like reaction: a retrospective review of 78 cases[J]. Int Surg, 2014, 99(2): 142-146. DOI:10.9738/INTSURG-D-13-00086.1
[3] 张春玲, 蔡尚郎. 冲击量还原型谷胱甘肽用于双硫醒样反应患者42例疗效观察[J]. 山东医药, 2008, 48(29): 103-103. DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2008.29.050
[4] Small SM, Bacher RS, Jost SA. Disulfiram-like reaction involving ceftriaxone in a pediatric patient[J]. J Pediatr Pharmacol Ther, 2018, 23(2): 168-171. DOI:10.5863/1551-6776-23.2.168
[5] Guler S, Aytar H, Soyuduru M, et al. Disulfiram-like reaction with ornidazole[J]. Am J Emerg Med, 2015, 33(9): 1330. DOI:10.1016/j.ajem.2015.03.022
[6] Tsukamoto H, Lu SC. Current concepts in the pathogenesis of alcoholicliver injury[J]. FASEB J, 2001, 15(8): 1335-1349. DOI:10.1096/fj.00-0650rev
[7] Jung TW, Lee JY, Shim WS, et al. Adiponectin protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against acetaldehyde-induced cytotoxicity[J]. Biochem Pharmacol, 2006, 72(5): 616-623. DOI:10.1016/j.bcp.2006.05.013
[8] 李芳芳, 张宇, 陈韶华, 等. 酒精灌胃大鼠全血乙醛浓度变化[J]. 浙江预防医学, 2004, 16(1): 13-14. DOI:10.19485/j.cnki.issn1007-0931.2004.01.007
[9] Liu L, Huang C, Bian Y, et al. GC-MS based metabolomics of CSF and blood serum: Metabolic phenotype for a rat model of cefoperazone-induced disulfiram-like reaction[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 490(3): 1066-1073. DOI:10.1016/j.bbrc.2017.06.167
[10] Bae KY, Kim SW, Shin HY, et al. The acute effects of ethanol and acetaldehyde on physiological responses after ethanol ingestion in young healthy men with different ALDH2 genotypes[J]. Clin Toxicol, 2012, 50(4): 242-249. DOI:10.3109/15563650.2012.672743
[11] Oba T, Maeno Y, Ishida K. Differential contribution of clinical amounts of acetaldehyde to skeletal and cardiac muscle dysfunction in alcoholic myopathy[J]. Curr Pharm Des, 2005, 11(6): 791-800. DOI:10.2174/1381612053381891
[12] Condouris GA, Havelin DM. Acetaldehyde and cardiac arrhythmias[J]. Arch Int Pharmacodyn Ther, 1987, 285(1): 50-59.
[13] 梁新乐, 孙伟民. 双硫仑样反应的研究进展[J]. 临床合理用药, 2017, 10(6A): 177-179. DOI:10.15887/j.cnki.13-1389/r.2017.16.105
[14] 熊建群, 高晓波, 何珍, 等. 双硫仑样反应及临床药物治疗进展[J]. 实用药物与临床, 2015, 18(5): 610-613. DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201505029
[15] Elenbaas RM. Drug therapy reviews: management of the disulfiram-alcohol reaction[J]. Am J Health-System Pharmacy, 1977, 34(8): 827-831. DOI:10.1093/ajhp/34.8.827
[16] 刘非凡, 尹慧娟, 杨李, 等. 地塞米松等药物对双硫仑样反应动物模型血管通透性的影响[J]. 华南国防医学杂志, 2012, 26(6): 562-564. DOI:10.13730/j.1009-2595.2012.06.013
[17] Pastore A, Federici G, Bertini E, et al. Analysis of glutathione: implication in redox and detoxification[J]. Clin Chim Acta, 2003, 333(1): 19-39. DOI:10.1016/s0009-8981(03)00200-6
[18] Heit C, Dong H, Chen Y, et al. Transgenic mouse models for alcohol metabolism, toxicity, and cancer[J]. Adv Exp Med Biol, 2015, 815: 375-387. DOI:10.1007/978-3-319-09614-8_22
[19] Pivetta LA, Dafre AL, Zeni G, et al. Acetaldehyde does not inhibit glutathione peroxidase and glutathionereductase from mouse liver in vitro[J]. Chem Biol Interact, 2006, 159(3): 196-204. DOI:10.1016/j.cbi.2005.11.006
[20] Orrenius S, Moldéus P. The multiple roles of glutathione in drug metabolism[J]. Trend Pharmacol Sci, 1984, 5(10): 432-435. DOI:10.1016/0165-6147(84)90495-4
[21] Matsufuji Y, Yamamoto K, Yamauchi K, et al. Novel physiological roles for glutathione in sequestering acetaldehyde to confer acetaldehyde tolerance in Saccharomyces cerevisiae[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(1): 297-303. DOI:10.1007/s00253-012-4147-4