中华急诊医学杂志  2020, Vol. 29 Issue (2): 243-246   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2020.02.0025
microRNA125a对缺血-再灌注心肌组织中巨噬细胞极化的影响
郭冬娜 , 冀兵 , 耿丽娟 , 李琼洁 , 王云俊     
山西医科大学附属第一医院急诊医学中心,030001 太原
摘要: 目的 探讨microRNA125a在心肌缺血-再灌注中浸润巨噬细胞的表达,初步分析microRNA125a对心肌缺血-再灌注中浸润巨噬细胞极化的影响。方法 建立大鼠心肌缺血-再灌注模型,取心肌损伤组织,分离浸润巨噬细胞,提取RNA。Qrt-PCR方法首先检测巨噬细胞中M1和M2标志分子,评估浸润巨噬细胞的类型。随后检测microRNA125a在浸润巨噬细胞中的表达水平,最后通过干预microRNA125a在巨噬细胞中的表达,进一步阐明microRNA125a对巨噬细胞极化的影响。结果 缺血-再灌注心肌组织中巨噬细胞高表达M1标志分子(TNF-α和IL-8),呈现M1型巨噬细胞。同时microRNA125a在此巨噬细胞中也高表达。体外干预巨噬细胞中microRNA125a可以影响巨噬细胞的极化方向和水平。结论 缺血-再灌注心肌组织中的巨噬细胞呈M1型,microRNA125a在此巨噬细胞中高表达并促进了其向M1型偏移。
关键词: microRNA125a    心肌缺血-再灌注    巨噬细胞    
Effect of microRNA125a on macrophage polarization during myocardial ischemia reperfusion
Guo Dongna , Ji Bing , Geng Lijuan , Li Qiongjie , Wang Yunjun     
Department of Emergency Medince, The First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001 China
Abstract: Objective To investigate the expression of microRNA125a in infiltrating macrophages during myocardial ischemia reperfusion, and to analyze the effect of microRNA125a on the polarization of infiltrating macrophages during myocardial ischemia reperfusion. Methods The rat model of myocardial ischemia-reperfusion was established. Myocardial injury tissues were taken, infiltrated macrophages were isolated, and RNA was extracted. qRT-PCR was used to detect M1 and M2 markers in macrophages and evaluate the types of infiltrated macrophages. Subsequently the expression level of microRNA125a in infiltrating macrophages was detected. Finally, the effect of microRNA125a on macrophage polarization was further elucidated. Results Macrophages in myocardium of ischemia reperfusion showed high expression of M1 markers (TNF-alpha and IL-8), presenting M1 macrophages. At the same time, microRNA125a was also highly expressed in this macrophage. Knockdown or overexpression of microRNA125a in macrophages in vitro can affect the macrophages polarization. Conclusions Macrophages in myocardial ischemia reperfusion are M1 type, and microRNA125a is highly expressed in this macrophage and promotes its migration to M1 type.
Key words: MicroRNA125a    Myocardial ischemia reperfusion    Macrophage    

严重大面积的心肌梗死可导致心力衰竭,致使患者猝死[1]。尽早实施缺血心肌再灌注是目前最为有效的临床救治方法。但是再灌注救治是把双刃剑,既可以及时恢复心肌血供,改善心肌功能,又可在少数情况下却加重心肌坏死[2]。研究表明,缺血-再灌注所导致的心肌坏死与再灌注后出现大量炎性因子密切相关[3]。心肌缺血-再灌注损伤过程中巨噬细胞大量浸润在心肌组织内,巨噬细胞可分泌大量炎性因子,参与缺血-再灌注损伤[4]

巨噬细胞是一群异质性的免疫细胞,依据其功能的不同分为经典活化巨噬细胞(M1)和替代活化巨噬细胞(M2)[5]。以往的研究表明[6],M1型巨噬细胞所分泌的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、iNOS、MCP-1等炎性因子促进缺血-再灌注部位的炎性反应,加重心肌损伤。而M2型巨噬细胞通过分泌TGF-β、IL-10等抑制过度免疫反应[7]。因此,抑制巨噬细胞向M1极化,促进其向M2偏移,对于减缓心肌缺血-再灌注损伤有着非常重要的意义。

微小RNA(microRNA)是一类非编码RNA,长度在21-23nt,其通过与靶mRNA的3‘非编码区结合,抑制其正常翻译[8]。microRNA在肿瘤、、代谢、炎症等疾病发生发展中起到非常重要的作用[9]。既往研究提示[10]microRNA125a在巨噬细胞功能的调控中起关键作用。本研究将检测在大鼠心肌缺血-再灌注心肌组织中巨噬细胞内microRNA125a表达水平,同时进一步探讨microRNA125a对巨噬细胞极化的影响及机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

实验用清洁级6~8周雄性SD大鼠20只购于上海必凯实验动物中心。

1.2 试剂

Trizol RNA抽提试剂盒购于美国life公司; 定量PCR检测试剂盒购于美国life公司; microRNA125a inhibitor和mimics由上海吉玛生物科技有限公司合成; Lipofectamine 2000转染试剂购于美国life公司; 大鼠重组M-CSF购自美国peprotech; DMEM培养液,胎牛血清,胰酶均购于美国life公司。大鼠CD11b-FITC,F4/80-PE抗体购于美国BD公司。各基因引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。

1.3 实验方法 1.3.1 缺血-再灌注损伤模型的建立

将SD大鼠以每组10只随机(随机数字法)分为I/R组和假手术组,所有大鼠经10%水合氯醛麻醉后,固定,行气管插管,接通呼吸机机械通气。对I/R组大鼠结扎冠状动脉30 min后松开建立心肌缺血大鼠模型,在恢复供血后再灌注2 h。实验过程中采用心电图进行监测,在结扎后,出现心电图ST段抬高、T波高耸等表现,而松开动脉夹开放供血后,出现抬高的ST段开始降低、T波慢慢恢复的现象,则表示I/R建模成功。

1.3.2

损伤心肌组织巨噬细胞分离:取大鼠受损心肌组织,用胶原蛋白酶I和IV以及透明质酶37℃处理两h,研磨至单个细胞悬液。加入大鼠CD11b-FITC,F4/80-PE抗体避光孵育20 min,FACS液洗涤后,流式细胞仪进行分选CD11b+F4/80+巨噬细胞。

1.3.3 RNA提取

将分离收集到的巨噬细胞用Trizol裂解,加氯仿进行震荡。13 000转离心5 min后取上清液,加入无水乙醇沉淀。75%乙醇洗涤后,晾干加双蒸无菌水溶解。

1.3.4 定量PCR检测

将上述质量检测良好的总RNA样本采用逆转录试剂盒转录成cDNA,接着按照SubGreen PCR Mix说明书进行qRT-PCR,所有反应均设立3个复孔。记录每个反应管中标本的CT值。本研究结果采用qRT-PCR中的相对定量法进行分析,采用2-△△CT法表示大鼠心肌缺血-再灌注组织巨噬细胞内microRNA125a以及IL-8,TNF-α,iNOS,MCP-1,TGF-β,IL-10 mRNA表达水平相对于骨髓巨噬细胞表达水平的变化倍数。

1.3.5 原代骨髓巨噬细胞制备

取大鼠股骨,用PBS将骨髓腔冲净,体外将骨髓制备成单细胞悬液。红细胞裂解液破坏红细胞后,接种培养皿中加入重组因子M-CSF进行巨噬细胞的诱导。48 h后去除所有悬浮细胞,继续加入带有M-CSF的培养液继续培养48h。所得到细胞即为巨噬细胞。

1.3.6 细胞转染及分组

将制备的原代巨噬细胞,调整细胞密度为1×106个/ml后接种于24孔细胞板上,置于CO2培养箱中常规培养24h。将其随机(随机数字法)分为对照组,microRNA125a NC组,microRNA125a mimics组,miR-125a inhibitor组,每组含有3个复孔。以Lipofectamine2000将上述RNA分别转染至相应巨噬细胞细胞中,空白对照组细胞不做转染。转染6 h后,更换培养液后继续培养48 h。定量PCR验证转染成功后,加入TNF-α诱导M1型巨噬细胞。24 h后,收集细胞行定量PCR实验检测TNF-α,iNOS,MCP-1,TGF-β,IL-10 mRNA表达水平。

1.3.7 统计学方法

采用Graph Prism 5.0统计软件进行统计学分析。心肌缺血-再灌注组织中巨噬细胞和骨髓巨噬细胞内microRNA125a以及IL-8,TNF-α,iNOS,MCP-1,TGF-β,IL-10 mRNA表达水平组间比较采用两组间样本均数t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 缺血-再灌注心肌组织浸润巨噬细胞为M1型巨噬细胞

为了检测缺血-再灌注心肌组织浸润巨噬细胞的类型,首先从缺血-再灌注大鼠心肌组织中分离浸润巨噬细胞,定量PCR检测心肌组织浸润巨噬细胞内M1和M2相关细胞因子的表达。其中TNF-α和IL-8属于M1型巨噬细胞相关细胞因子,TGF-β和IL-10属于M2型巨噬细胞相关细胞因子。结果显示,TNF-α和IL-8在缺血-再灌注心肌组织浸润巨噬细胞的表达与骨髓巨噬细胞相比,明显上升; 而TGF-β和IL-10比骨髓巨噬细胞呈现显著降低。这预示缺血-再灌注心肌组织浸润巨噬细胞为M1型巨噬细胞,所产生的细胞因子可以促进缺血-再灌注部位炎症发生和心肌损伤。

2.2 缺血-再灌注心肌组织浸润巨噬细胞高表达microRNA125a

为了观察缺血-再灌注后心肌组织浸润巨噬细胞内是否高表达microRNA125a,首先从大鼠缺血-再灌注模型心肌组织内分离巨噬细胞,抽提其中RNA后,定量PCR分析microRNA125a的表达。大鼠骨髓巨噬细胞作为对照。结果显示,心肌组织浸润巨噬细胞内的microRNA125a的表达水平明显高于骨髓巨噬细胞。这预示microRNA125a与巨噬细胞向M1极化相关联。

2.3 microRNA125a促进心肌组织浸润巨噬细胞向M1方向偏移

为了进一步验证microRNA125a可以促进巨噬细胞向M1方向极化,分离培养原代骨髓巨噬细胞,分别用microRNA125a NC,microRNA125a mimics,microRNA125a inhibitor进行转染。在确定microRNA125a在巨噬细胞的表达水平后,定量PCR检测M1和M2相关细胞因子的表达。如图 3显示,与microRNA125a NC转染组相比,microRNA125a mimic转染组的TNF-α和IL-8的表达水平明显升高,而TGF-β和IL-10的表达水平明显下降。同时,microRNA125a inhibitor抑制TNF-α和IL-8的表达,促进TGF-β和IL-10的表达。这一结果提示,microRNA125a在巨噬细胞的极化中起关键作用,促进巨噬细胞向M1方向偏移。

图 1 缺血-再灌注心肌组织浸润巨噬细胞高表达M1标志分子 Fig 1 The high expression of M1 marker in the infiltrating macrophages during myocardial ischemia reperfusion

图 2 缺血-再灌注心肌组织浸润巨噬细胞高表达microRNA125a Fig 2 Up-regulation of microRNA125a in the infiltrating macrophages during myocardial ischemia reperfusion

图 3 microRNA125a促进心肌组织浸润巨噬细胞向M1方向偏移 Fig 3 microRNA125a promoting migration of infiltrating macrophages to M1 during myocardial ischemia reperfusion
3 讨论

缺血-再灌注损伤是急性心肌梗死治疗后常见症状,通常伴随大量免疫细胞浸润,诱发炎症反应,加重心肌损伤[2]。大量的研究表明,单核/巨噬细胞是其中重要的免疫细胞。单核/巨噬细胞可长期存在于心肌损伤部位,一方面参与心肌损伤后心肌重构,血管形成以及损伤部位修复,另一方面它可引起持续的炎症反应,阻碍心肌修复进程。而巨噬细胞的不同作用与它的表型密切相关。通常M1型巨噬细胞不利于心肌组织修复,M2型巨噬细胞促进心肌重构[11-12]

因此有效诱导巨噬细胞向M2方向偏移是降低心肌缺血-再灌注损伤的有效途径,也是近来研究的热点。近来,化合物诱导、输注间充质干细胞以及注射带有诱导M2巨噬细胞基因的病毒等方法在抑制缺血-再灌注损伤方面取得了一定的疗效,也为后续的研究指明了方向。本研究在大鼠心肌缺血-再灌注模型中发现,mirRNA125a在心肌损伤部位的巨噬细胞中高表达,干预microRNA125a的表达可以有效诱导心肌损伤部位的巨噬细胞由M1表型向M2表型偏移,同时能明显改善心肌的缺血-再灌注损伤。

MicroRNA125a在肿瘤发生、代谢障碍、炎症发生中均起到重要作用[13]。有研究表明[14],MicroRNA125a在缺血-再灌注损伤时在心肌内也呈高表达,损伤心肌的凋亡也起促进作用。我们研究进一步表明,microRNA125a不仅仅能直接影响心肌细胞,而且可以间接通过调节巨噬细胞的极化来改变炎症反应促进缺血-再灌注损伤。

在缺血-再灌注过程中,大量的巨噬细胞浸润在损伤部位。大量巨噬细胞可以通过分泌大量细胞因子诱导血管收缩,释放氧自由基,促进炎症反应等机制加速心肌细胞坏死和血栓形成。浸润在心肌缺血-再灌注损伤部位的巨噬细胞体现出M1表型[15]。因此诱导这些巨噬细胞向M2偏移,一方面可以抑制炎症反应的发生,另一方面M2型巨噬细胞有利于损伤心肌的修复。

参考文献
[1] 吴晓燕, 苗琳, 郑蕊, 等. 心肌缺血再灌注损伤的研究进展[J]. 中国临床药理学杂志, 2016, 32(11): 1043-1045. DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2016.11.026
[2] 胡丽英, 李桂梅, 陈凤英. 急性心肌梗死再灌注治疗现状分析[J]. 重庆医学, 2017, 46(16): 2290-2292. DOI:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.042
[3] Westman PC, Lipinski MJ, Luger D, et al. Inflammation as a driver of adverse left ventricular remodeling after acute myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardiol, 2016, 67(17): 2050-2060. DOI:10.1016/j.jacc.2016.01.073
[4] Lu WB, Cong F, Xin W, et al. TCTAP A-041 inhibiting mobilization of Ly6Chigh monocytes after acute myocardial infarction enhanced the efficacy of mesenchymal stromal cells transplantation and curbed myocardial remodeling[J]. J Am Coll Cardiol, 2015, 65(17): S20-S21. DOI:10.1016/j.jacc.2015.03.094
[5] Cao Y, Xu Y, Auchoybur ML, et al. Regulatory role of IKKɑ in myocardial ischemia/reperfusion injury by the determination of M1 versus M2 polarization of macrophages[J]. J Mol Cell Cardiol, 2018, 123: 11-12. DOI:10.1016/j.yjmcc.2018.08.021
[6] Wang LX, Zhang SX, Wu HJ, et al. M2b macrophage polarization and its roles in diseases[J]. J Leukoc Biol, 2019, 106(2): 345-358. DOI:10.1002/JLB.3RU1018-378RR
[7] Kasikara C, Doran AC, Cai BS, et al. The role of non-resolving inflammation in atherosclerosis[J]. J Clin Investig, 2018, 128(7): 2713-2723. DOI:10.1172/jci97950
[8] Mirna M, Paar V, Rezar R, et al. MicroRNAs in inflammatory heart diseases and sepsis-induced cardiac dysfunction: A potential scope for the future?[J]. Cells, 2019, 8(11): 1352. DOI:10.3390/cells8111352
[9] Moloney GM, Dinan TG, Clarke G, et al. Microbial regulation of microRNA expression in the brain–gut Axis[J]. Curr Opin Pharmacol, 2019, 48: 120-126. DOI:10.1016/j.coph.2019.08.005
[10] Schulert GS, Fall N, Harley JB, et al. Monocyte MicroRNA expression in active systemic juvenile idiopathic arthritis implicates MicroRNA-125a-5p in polarized monocyte phenotypes[J]. Arthritis Rheumatol, 2016, 68(9): 2300-2313. DOI:10.1002/art.39694
[11] Jing R, Long TY, Pan W, et al. IL-6 knockout ameliorates myocardial remodeling after myocardial infarction by regulating activation of M2 macrophages and fibroblast cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2019, 23(14): 6283-6291. DOI:10.26355/eurrev_201907_18450
[12] Westman PC, Lipinski MJ, Luger D, et al. Inflammation as a driver of adverse left ventricular remodeling after acute myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardiol, 2016, 67(17): 2050-2060. DOI:10.1016/j.jacc.2016.01.073
[13] Essandoh K, Li YT, Huo JZ, et al. MiRNA-mediated macrophage polarization and its potential role in the regulation of inflammatory response[J]. Shock, 2016, 46(2): 122-131. DOI:10.1097/shk.0000000000000604
[14] Sun T, Dong YH, Du W, et al. The role of MicroRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application[J]. IJMS, 2017, 18(4): 745. DOI:10.3390/ijms18040745
[15] Epelman S, Liu PP, Mann DL. Role of innate and adaptive immune mechanisms in cardiac injury and repair[J]. Nat Rev Immunol, 2015, 15(2): 117-129. DOI:10.1038/nri3800