2016年国际专家共识更新了脓毒症的定义^[1-2]，脓毒症是感染后发生的机体反应失调，可以导致免疫功能抑制和多脏器功能衰竭，继而威胁患者的生命^[3]。机体免疫功能失衡参与了脓毒症的发生发展^[4]，由于细胞凋亡和免疫抑制等因素，脓毒症患者外周血T细胞数量发生变化^[5-6]。白细胞介素-35（IL-35）是一种新型的抑制性细胞因子，属于IL-12细胞因子家族，主要发挥调控T细胞功能的作用，参与自身免疫性疾病、感染和肿瘤的发病^[7]。但是有关IL-35对脓毒症患者T细胞调控作用的研究较少。因此，本研究检测脓毒症患者血浆IL-35水平，利用体外细胞培养系统观察IL-35对脓毒症患者CD4⁺和CD8⁺T细胞活性的影响，探讨IL-35在脓毒症发病中的可能机制。

本研究为前瞻性队列研究。选取2018年1月至2018年9月山西省人民医院重症医学科收治的脓毒症患者。纳入标准：（1）年龄≥18岁且 < 65岁；（2）诊断符合2016年国际脓毒症专家共识标准^[1-2]：可疑感染者、序贯器官衰竭评分（SOFA）增加2分。排除标准：（1）长期使用免疫抑制剂；（2）恶性肿瘤；（3）妊娠期或哺乳期妇女；（4）重要脏器功能不全；（5）自身免疫性疾病；（6）慢性病毒感染性疾病。共纳入41例脓毒症患者，男24例，女17例，年龄20~63岁，（51.4±11.2）岁。感染部位：呼吸系统19例，消化系统13例，泌尿系统5例，皮肤软组织2例，其他部位2例。SOFA评分：2~6分15例，7~12分21例，13~18分5例，≥19分0例。选择同期在我院进行查体的健康对照者19例，男13例，女6例，年龄23~64岁，（47.6±9.9）岁。本研究已获得山西省人民医院伦理委员会批准，所有患者及家属均行告知并签署知情同意书。

美国Sigma 3-16K离心机；美国Bio-Rad iMark微孔读板仪；美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪和Trucount绝对计数管；德国美天旎公司MACS适配细胞磁力分离架；美国Applied Biosystems公司ABI 7500实时定量PCR仪。人外周血淋巴细胞分离液（密度：1.077 g/mL）（货号：P8610）购自北京索莱宝科技有限公司；抗CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP单克隆抗体（货号：340298）购自美国BD公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）（货号：CSB-E04740h）、干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）（货号：CSB-E04577h）、IL-4（货号：CSB-E04633h）、IL-10（货号：CSB-E04593h）、IL-17（货号：CSB-E12819h）和IL-35（货号：CSB-E13126h）酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测试剂盒购自武汉华美公司；CD4⁺细胞分选试剂盒（货号：130-096-533）和CD8⁺细胞分选试剂盒（货号：130-096-495）购自德国美天旎公司；重组人IL-35（货号：200-37）购自美国Peprotech公司；Trizol试剂（货号：15596018）购自美国Invitrogen公司；PrimeScript RT Master Mix反转录试剂盒（货号：RR036A）和TB Green实时定量PCR试剂盒（货号：RR82LR）购自北京宝日生物公司，引物由上海生工合成。

脓毒症患者于就诊本院1 h内、对照组于清晨空腹采集EDTA抗凝静脉外周血10 mL。2 880 r/min离心10 min，留取上层血浆冻存于-80 ℃备用。使用人外周血淋巴细胞分离液、采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），冻存于液氮中备用。

对CDs3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞计数进行检测，使用Trucount绝对计数管加入抗CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP单克隆抗体在FACS Calibur流式细胞仪自动分析软件中测定。ELISA法检测血浆IL-35水平，按说明书进行操作。使用CD4⁺和CD8⁺细胞分选试剂盒、采用磁力分离法对PBMC中的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞进行分选，分别取10⁵个CD4⁺T细胞和10⁵个CD8⁺T细胞，加入抗CD3/CD28抗体（终浓度1 μg/mL）刺激培养，同时加入重组人IL-35（终浓度1 ng/mL）共刺激培养48 h，收集细胞，使用Trizol试剂提取总RNA，反转录为cDNA，实时定量PCR法对CD4⁺T细胞中T-bet、GATA-3、FoxP3、RORγt mRNA和CD8⁺T细胞中穿孔素、颗粒酶B和FasLmRNA 的 相对表达量进行检测，引物序列参考既往文献^[8-9]合成。PCR扩增反应为20 μL反应体系，反应条件：预变性：95 ℃ 30 s；PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。应用2^-ΔΔCT法分析目的基因相对表达量。收集培养上清，ELISA法检测CD4⁺T细胞培养上清中的IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17和CD8⁺T细胞培养上清中的IFN-γ和TNF-α，按说明书进行操作。

数据均采用SPSS 21.0软件进行分析。首先对数据正态性进行检测，对符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验或配对t检验，两个连续变量的相关性分析采用Pearson相关分析。对于不符合正态分布的计量资料采用中位数[四分位间距][M（Q_L, Q_U）]表示，组间比较采用Mann-Whitney检验，两个连续变量的相关性分析采用Spearman相关分析。采用受试者工作者特征（receiver operating characteristic, ROC）分析IL-35和T细胞计数预测患者28 d生存结局。以P < 0.05为差异有统计学意义。

脓毒症患者血浆IL-35水平较健康对照者显著升高（表 1），但与入院时SOFA评分无显著相关性（r=0.172，P=0.281）。根据患者入院后28 d生存结局，将41例患者分为存活组（n=30）和死亡组（n=11），死亡组患者血浆IL-35水平显著高于存活组（表 2）。将存活组和死亡组患者血浆IL-35水平进行ROC曲线分析，得ROC曲线，如图 1A，曲线下面积（area under curve, AUC）为0.770，P=0.009，提示血浆IL-35的生存结局预测效能较好。

A：AUC=0.770，P=0.009；B：AUC=0.647，P=0.154；CAUC=0.664，P=0.112；D：AUC=0.646，P=0.158 图 1 预测脓毒症预后的ROC曲线 Fig 1 The ROC curve of prognosis of sepsis

图选项

脓毒症患者CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞计数与健康对照者的差异无统计学意义（表 1），但CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞计数与入院时SOFA评分均呈显著负相关（r=-0.415，P=0.007；r=-0.437，P=0.004；r=-0.405，P=0.009），与血浆IL-35水平无显著相关性（均P > 0.05）。但CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞计数在存活组和死亡组之间的差异无统计学意义（表 2）。ROC曲线分析发现，CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞计数的AUC分别为0.647、0.664和0.646，P值分别为0.154、0.112和0.158，提示T细胞计数的生存结局预测效能较差（图 1B、1C和1D）。

分选22例脓毒症患者外周血CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，使用重组人IL-35刺激培养48 h后收集培养上清和细胞。IL-35刺激的CD4⁺T细胞中Th1转录因子T-bet和Th17转录因子RORγtmRNA的相对表达量较无IL-35刺激的CD4⁺T细胞显著降低，调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）转录因子FoxP3 mRNA的相对表达量则显著升高，Th2转录因子GATA-3 mRNA的相对表达量在IL-35刺激和无IL-35刺激的CD4⁺T细胞中的差异无统计学意义（表 3）。与之相似的是，IL-35刺激的CD4⁺T细胞分泌Th1细胞因子IFN-γ和Th17细胞因子IL-17的水平较无IL-35刺激的CD4⁺T细胞显著降低，Treg细胞因子IL-10的分泌水平明显升高，Th2细胞因子IL-4的水平在IL-35刺激和无IL-35刺激的CD4⁺T细胞中的差异则无统计学意义（表 3）。IL-35刺激的CD8⁺T细胞中穿孔素和颗粒酶B mRNA相对表达量较无IL-35刺激的CD8⁺T细胞显著降低，而FasL mRNA相对表达量则无显著变化。IL-35刺激的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平较无IL-35刺激的CD8⁺T细胞显著降低（表 4）。

本研究发现，脓毒症患者外周血IL-35水平较健康对照者显著升高，这与既往在脓毒症患者和脓毒症动物模型中的结果一致^[10-11]。IL-35水平在脓毒症早期诊断和预后预测中的价值高于常规检查指标（如白细胞、降钙素原）^[12]。由于IL-35可促进细菌感染播散、减少中性粒细胞浸润、抑制核因子-κB活性、降低细胞因子和趋化因子分泌^{[7, 13]}，上述因素均可促进脓毒症的疾病进展。因此，IL-35升高表达可能成为脓毒症患者生存预后不良的重要预测因素之一。

IL-35主要通过抑制T细胞活性发挥生物学功能。本研究发现脓毒症患者外周血T细胞计数与对照组无显著差异，这与既往结果不尽相同^[5]。但T细胞计数与SOFA评分呈显著负相关，提示脓毒症患者中可能存在T细胞功能障碍。初始CD4⁺T细胞在抗原刺激和转录因子作用下可分化为不同亚群，主要包括Th1、Th2、Treg和Th17细胞。在恶性肿瘤和病毒感染过程中，IL-35对CD4⁺T细胞的调控作用主要通过促进Treg和抑制Th17细胞功能而实现，主要表现为IL-35刺激不但诱导CD4⁺T细胞中FoxP3表达、促进IL-10/IL-35分泌^[14]，还可抑制RORγt表达和IL-17/IL-22分泌^[15]。本研究结果提示，脓毒症患者外周血升高表达的IL-35也可促进Treg功能，抑制Th1和Th17细胞活性，进而可诱导效应免疫细胞增殖减弱，细胞因子分泌减少，在脓毒症中发挥免疫抑制作用。

CD8⁺T细胞不但可通过穿孔素-颗粒酶、Fas-FasL两条途径发挥直接细胞杀伤功能，亦可分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子通过非细胞杀伤作用诱导靶细胞死亡^[16]。IL-35刺激脓毒症患者的CD8⁺T细胞仅抑制穿孔素和颗粒酶B mRNA，对FasL mRNA则无显著影响，提示在脓毒症中IL-35可能主要通过影响穿孔素-颗粒酶途径抑制CD8⁺T细胞的直接细胞杀伤功能。IL-35刺激后脓毒症患者CD8⁺T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平显著降低，提示IL-35亦可影响CD8⁺T细胞的非细胞杀伤作用，这与在骨肿瘤中的研究结果一致^[17]。因此，脓毒症患者外周血中升高表达的IL-35可能直接抑制CD8⁺T细胞的直接细胞杀伤和非细胞杀伤功能。

总之，血浆IL-35的表达升高对脓毒症患者的预后不佳有重要提示意义。IL-35抑制脓毒症患者CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞活性，可能参与脓毒症的发病过程。