TNF-α是急性肺损伤（acute lung injury, ALI）时介导炎症反应的主要因子，参与ALI的发生及发展^[1]。肺上皮屏障调控并维持肺内外液体平衡，是ALI的关键病理部位。肺泡上皮细胞和细胞间紧密连接共同维持肺上皮屏障的功能^[2]。紧密连接为细胞-细胞间连接复合体，主要由Claudins、Occludin、ZO-1等组成，调控细胞旁通透性^[3-5]。本研究通过探究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对肺泡Ⅱ型上皮细胞及其紧密连接蛋白Claudin-4、ZO-1表达的影响，初步探讨TNF-α对肺上皮屏障功能的影响。

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelial type Ⅱ cells, AEC-Ⅱ）（上海拜力生物有限公司，中国）。将细胞分为正常对照组：用含10%胎牛血清（Gibco公司，美国）的DME F12（HyClone公司，美国）培养液孵育贴壁细胞。TNF-α24 h、48 h、72 h组：分别用等体积的TNF-α10 ng/mL（Pepprotech公司，美国）培养液刺激贴壁细胞24 h、48 h、72 h。

收集对照组及处理结束后的各组细胞，用0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液洗涤细胞，2%戊二醛重悬细胞，4 ℃放置1 h。1%锇酸浸泡1 h，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%的酒精脱水，环氧丙烷渗透，包埋液包埋，用超薄切片机切成50 nm的切片，3%醋酸枸橼酸银染色。透射电子显微镜（日立H7650，日本）观察细胞超微结构。

取对数生长期的细胞，细胞计数，调整细胞密度为1×10⁵个/mL，以5 000个细胞/孔的密度均匀接种于96孔板中，置于37 ℃、含5% CO₂的培养箱中孵育24 h，按照实验分组处理细胞，每组设置3个复孔，处理结束后，更换为无血清培养基90 μL/孔，加入20 μL 1×MTT溶液，37 ℃避光孵育4 h，将MTT还原为甲瓒，加入150 μL DMSO溶解甲瓒，水平振荡10 min摇匀，酶标仪在490 nm波长处测定每孔吸光度值（A值）。计算细胞增殖抑制率=（A_对照组-A_实验组）/A_对照组×100%。

取对数生长期的细胞以1×10⁵个/mL接种于六孔板中，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养24 h后，按照实验分组处理细胞，每组设2个复孔，处理结束后，按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物公司，中国）说明书进行操作，用流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。

将生长状态良好的AEC-Ⅱ细胞以1×10⁵个/mL均匀接种于置有无菌爬片的六孔板内，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养24 h，按照实验分组处理细胞，处理结束后用多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤细胞，5%BSA室温封闭1 h，Claudin-4抗体（1:50，Invitrogen公司，美国），ZO-1抗体（1:50，Invitrogen公司，美国）4 ℃孵育过夜，洗涤，用FITC标记的二抗（1:50，北京中杉金桥生物公司，中国）室温避光孵育1 h，再洗涤、DAPI染核封片。共聚焦显微镜（Olympus FV1000，Olympus公司，美国）观察并拍照。

将生长状态良好的AEC-Ⅱ以适当密度均匀接种于六孔板内，孵育24 h后，按照实验分组处理细胞，处理结束后，提取细胞总RNA（Trizol法），反转录成cDNA，应用LightCycler480 System进行Real-time PCR反应。记录CT值。β-actin作为内参。

将细胞均匀接种于六孔板内，孵育24 h后，按照实验分组干预细胞，干预结束后，提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，配胶、上样、电泳，转膜（300 mA，1.5 h），5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入Claudin-4抗体（1:500，Invitrogen公司，美国），ZO-1抗体（1:250，Invitrogen公司，美国），β-actin抗体（1:500，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国）4℃孵育过夜，洗涤，用辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5 000，北京中杉金桥生物公司，中国）室温孵育2 h，洗涤，ECL化学发光显影，曝光，成像。用Image Lab分析软件进行图像的分析处理，并测定各条带的灰度值，用目的条带的灰度值/对应内参的灰度值，反映各组蛋白相对表达的变化。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，对数据进行正态性和方差齐性检验，若满足正态性，方差齐，则多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。若不符合正态性，方差不齐，则用秩转换的非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

透射电镜鉴定AEC-Ⅱ，观察结果如图 1所示。镜下可见对照组AEC-Ⅱ细胞表面有数量不等、长短不一的微绒毛，胞质均匀，可见线粒体、高尔基体、内质网等细胞器，并可见典型的板层小体结构，数量不等，大小不一，成熟阶段不同，围绕细胞核散在分布。细胞核染色质均匀。确定本研究所用细胞为肺泡Ⅱ型上皮细胞。TNF-α刺激细胞24 h即可见细胞的形态发生改变，细胞内板层小体逐渐空泡化，线粒体及内质网水肿，随着作用时间的延长，细胞形态扭曲更明显，板层小体排空现象更为严重，线粒体水肿明显加重，嵴逐渐溶解、断裂，直至消失。细胞核固缩，核溶解，视野中凋亡细胞比例增加。

A:正常对照组; B: TNF-α 24 h组; C:TNF-α 48 h组; D:TNF-α 72 h组 图 1 大鼠AEC-Ⅱ超微结构及TNF-α刺激后变化（×10 000，醋酸枸橼酸银染色） Fig 1 Ultrastructure of rat AEC-Ⅱ and changes after TNF-α intervention (×10 000, silver citrate acetate staining)

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TNF-α刺激细胞24 h时，细胞的增殖抑制率（6.15±4.33）%明显高于对照组（0.00±2.17）%（P < 0.05）; 随着刺激时间的延长，细胞的增殖抑制率逐渐升高[48 h：(24.55±1.10)%; 72 h：(64.40±5.59)%]，各组间差异均有统计学意义（均P < 0.01）。TNF-α 24 h组细胞的早期凋亡率（4.77±0.72）%较对照组（1.80±0.36）%明显升高（P < 0.01），TNF-α刺激48 h、72 h时，细胞的早期凋亡率[(9.57±0.71)%; (16.73±1.38)%]继续增加（均P < 0.01）; 从流式细胞仪分析图（图 3B）中也可见; 细胞的早期凋亡率（右下象限）在TNF-α刺激后逐渐升高，说明TNF-α抑制AEC-Ⅱ细胞的增殖，诱导其凋亡，具有时间依赖效应。见图 2~3。

与对照组比较, aP < 0.05;与TNF-α 24 h比较, bP < 0.05;与TNF-α 48 h比较，cP < 0.05 图 2 AEC-Ⅱ增殖抑制率的变化 Fig 2 Changes of proliferation inhibition rate of AEC-Ⅱ cells

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（A）与对照组比较, aP < 0.05;与TNF-α 24 h比较, bP < 0.05;与TNF-α 48 h比较，cP < 0.05;（B）十字线把图分为四个象限，左上象限代表坏死细胞比例，左下象限表示正常细胞比例，右上象限为晚期凋亡细胞比例，右下象限为早期凋亡细胞比例 图 3 AEC-Ⅱ早期凋亡率的变化 Fig 3 Changes of early apoptotic rate of AEC-Ⅱcells

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对照组ZO-1沿着细胞膜的内表面分布，镜下呈连续的线状带分布在细胞的边缘及细胞连接部位，在细胞间连接成网。TNF-α作用24 h时，ZO-1蛋白的荧光强度与对照组相比稍减弱，但线性结构基本完整，仅有少部分发生断裂。48 h时，ZO-1线性结构断裂明显，镜下可见断续的线状片段，少见完整的网状结构，ZO-1向胞质内移位。作用72 h时，ZO-1的荧光强度显著降低，几乎看不到线性结构，呈现散在分布的荧光点。对照组Claudin-4在细胞膜表面呈散点状荧光分布，TNF-α作用24 h时，Claudin-4荧光点强度较对照组减弱，数量较对照组明显减少; 继续作用至48 h时，Claudin-4的荧光强度继续减弱，荧光密度继续降低; 到72 h时，视野中仅可见少量极其微弱的荧光点，有的视野中甚至无荧光显像，见图 4。

图 4 紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-4在大鼠AEC-Ⅱ的表达分布变化（箭头示紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-4） Fig 4 Changes in the expression and distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin-4 in rat AEC-Ⅱcells (the arrow indicates ZO-1 or Claudin-4)

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TNF-α24 h组ZO-1转录水平（0.92±0.05）与对照组比较无明显变化（P > 0.05），TNF-α48 h组的ZO-1 mRNA水平（0.28±0.06）明显下降（P < 0.01），TNF-α72 h组的ZO-1转录水平继续降低（0.13±0.07）。而Claudin-4的mRNA水平在TNF-α刺激细胞24 h即出现显著降低（0.16±0.03），与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。TNF-α继续作用至48 h、72 h，Claudin-4 mRNA表达水平继续降低（0.04±0.01;0.01±0.00），各组间差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 5。

与对照组比较, aP < 0.05;与TNF-α 24 h比较, bP < 0.05;与TNF-α 48 h比较，cP < 0.05 图 5 大鼠AEC-Ⅱ的ZO-1（A）、Claudin-4（B）mRNA水平的变化 Fig 5 The changes of ZO-1 (A) and Claudin-4 (B) mRNA levels in rat AEC-Ⅱcells

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TNF-α 24 h组ZO-1蛋白的表达（0.63±0.07）较对照组（0.69±0.12）降低（P > 0.05），48 h组ZO-1的表达（0.44±0.09）较24 h组减低（P < 0.05），72 h组ZO-1蛋白表达（0.2±0.01）较48 h组显著降低（P < 0.05）。TNF-α各组细胞紧密连接蛋白Claudin-4的表达（24 h：0.49±0.08;48 h：0.34±0.05;72 h：0.04±0.01）均较对照组（0.96±0.13）降低（P < 0.01），且随着作用时间的延长，蛋白表达逐渐减少，各组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 6。

（A）ZO-1、Claudin-4、β-actin蛋白条带; ZO-1（B）、Claudin-4（C）表达的变化; 与对照组比较, aP < 0.05;与TNF-α 24 h比较, bP < 0.05;与TNF-α 48 h比较，cP < 0.05 图 6 大鼠AEC-Ⅱ紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-4蛋白表达的变化 Fig 6 The changes of ZO-1 and Claudin-4 proteins expression in rat AEC-Ⅱcells

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肺屏障由肺上皮屏障及肺微血管内皮屏障共同组成，肺上皮屏障较肺微血管屏障更为紧密^[6]，肺泡上皮对水溶性溶质的有效孔隙半径为0.9 nm，远小于微血管内皮细胞的7.5 nm，是诱导肺水肿发生的关键屏障结构^[7]。在各种原因导致的ALI中，肺泡上皮屏障功能受损也是ALI的重要病理生理变化，而残存的上皮屏障功能与患者病死率呈负相关^[8]。

TNF-α在细胞死亡及免疫细胞的募集和激活中至关重要，被认为是严重疾病的全身进展和组织损伤的标志性介质之一^[9]。本研究发现TNF-α作用于大鼠AEC-Ⅱ后，细胞形态发生扭曲变形，细胞结构明显损伤，随着作用时间的延长，细胞内板层小体逐渐排空，线粒体水肿，内质网扩张，还可见大量溶酶体样结构。因此，TNF-α可直接损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞。

本研究检测了TNF-α对大鼠AEC-Ⅱ增殖的影响，研究显示，TNF-α抑制AEC-Ⅱ的增殖，而AEC-Ⅱ为修复肺损伤、分泌表面活性物质的主要细胞，抑制AEC-Ⅱ的增殖将阻碍损伤肺组织的自我修复。研究显示，急性肺损伤时伴有肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡^[10-11]。在炎症反应时，TNF-α过表达通过活化Caspase-3，与肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）结合等多种途径诱导细胞凋亡^[12-13]。本研究结果显示TNF-α各组细胞早期凋亡率均较对照组升高，且随着作用时间的延长，凋亡率逐渐升高。在电镜下也观察到TNF-α组视野内部分细胞发生了核固缩，溶解，碎裂的现象，与流式细胞仪结果一致。说明TNF-α抑制大鼠AEC-Ⅱ的增殖，并诱导其凋亡，从而破坏肺上皮屏障的连续性，阻碍肺组织的自我修复，是导致上皮屏障通透性增加的重要原因。

调控肺上皮屏障功能更为关键的结构为肺上皮细胞间的紧密连接^[14-15]。紧密连接是一种细胞间连接复合体，高度定位于细胞与细胞连接部位^[16]。本研究通过免疫荧光染色，共聚焦显微镜下观察，紧密连接结构蛋白ZO-1在大鼠AEC-Ⅱ高表达，沿细胞膜呈线状分布，在相邻细胞间交织成网，形成横向等渗膜。跨膜蛋白Claudin-4在细胞膜表面呈散点状分布，与ZO-1共同调节细胞旁通透性。

本研究用TNF-α刺激细胞后，共聚焦显微镜下观察到细胞ZO-1的线状荧光出现断裂，随着作用时间的延长，部分线性结构消失，向胞质内移位。到72 h时，ZO-1线状结构基本消失，只呈现散在的荧光点。而ZO-1可以调节Claudin蛋白与紧密连接的结合，从而调节细胞旁离子交换^[14]。降低ZO-1的表达，可以使Claudin蛋白易于从紧密连接结构中脱落，从而使细胞间的紧密连接松弛^[17]。也有研究发现，TNF-α可以重新分布紧密连接蛋白，使紧密连接结构移位，从而影响细胞旁通透性^[18]。本研究也观察到TNF-α各组细胞Claudin-4的荧光强度较对照组明显降低，随着作用时间的延长，荧光点密度逐渐降低。说明TNF-α破坏ZO-1及Claudin-4在AEC-Ⅱ细胞的结构和改变紧密连接蛋白在细胞的分布，使紧密连接松弛。

肺上皮细胞主要表达Claudin-4、Claudin-18和Claudin-3，其中Claudin-4在肺泡液体清除中发挥关键作用^[19]。本课题组在前期研究中已发现急性肺损伤大鼠肺组织Claudin-5及ZO-1的表达下调，肺湿/干比值升高^[20];上调肺微血管内皮细胞Claudin-5、ZO-1的表达，保护肺损伤^[21]。说明Claudins及ZO-1表达的变化与肺损伤密切相关。本研究检测了TNF-α作用后的大鼠AEC-Ⅱ的Claudin-4、ZO-1的mRNA水平，发现细胞Claudin-4及ZO-1 mRNA的转录较对照组降低，在蛋白表达的实验中，同样发现TNF-α组Claudin-4及ZO-1的表达水平较对照组降低。这也同时印证了免疫荧光实验中观察到的TNF-α各组Claudin-4的荧光强度减低，荧光强度减弱; ZO-1的线性荧光强度减弱的结果。Yang等^[22]的研究也发现下调紧密连接蛋白Claudin-4、ZO-1、Occludin的表达可以降低肺泡Ⅱ型上皮细胞旁通透性，影响肺上皮屏障功能。因此，本研究中TNF-α降低AEC-Ⅱ的Claudin-4及ZO-1的转录，下调其表达，影响肺屏障。然而，关于TNF-α诱导AEC-Ⅱ细胞凋亡与下调细胞紧密连接蛋白表达是否存在直接相关性，目前尚未被证实，笔者将在今后的研究中继续深入探讨，进一步明确TNF-α损伤肺上皮屏障的更深一层机制。

综上所述，TNF-α损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，诱导其凋亡，破坏肺上皮屏障的连续性。同时，下调Claudin-4、ZO-1的转录及表达，改变其定位，破坏细胞间紧密连接结构，损伤肺上皮屏障。