脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍[1],是导致临床危重病患者死亡的重要原因之一,迄今尚无有效的治疗策略。心肌损伤是脓毒症和脓毒性休克的常见并发症。脓毒症时机体可产生炎性因子,主要有TNF-α、IL-1β、IL-6,这些炎性因子可通过直接或间接方式造成心肌损伤[2-3]。有研究指出LPS可诱导NF-κB、p38 MAPK信号通路的激活,进而介导下游炎症因子的高表达并导致炎症反应的发生[4]。黄芩苷是从植物黄芩中提纯出来的一种黄酮类化合物,具有广泛的药理特性,如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抑菌等[5-6]。有研究指出黄芩苷可以通过抑制炎症反应、氧化应激或减轻凋亡对脓毒症机体损伤具有保护作用[7-8],而黄芩苷在脓毒症心肌损伤方面研究较少。本研究通过体外实验初步探究黄芩苷对脂多糖诱导的H9C2心肌细胞炎症的影响及可能机制,为脓毒症心肌损伤提供新的理论策略。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂H9C2细胞株(美国菌种保藏中心),DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司,加利福尼亚,美国),黄芩苷(大连美仑生物生物技术有限公司,大连,中国),LPS(博蕴生物科技有限公司,上海,中国),CCK-8试剂盒(Dojindo公司,大阪,日本),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(西唐生物科技有限公司,上海,中国),BCA蛋白浓度测定试剂盒(温壳生物科技有限公司,浙江,中国),兔抗NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38 MAPK、p-p38 MAPK、IκBα、p-IκBα单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司,马萨诸塞州,美国),抗GAPDH单克隆抗体(温壳生物科技有限公司,浙江,中国),山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司,马萨诸塞州,美国)。
1.2 H9C2细胞培养及分组复苏后的H9C2细胞接种于玻璃培养瓶中, 培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2条件下培养,当长至80%融合时,用含胰蛋白酶-EDTA消化、传代,将生长至80%融合的细胞用于实验。实验分组如下:健康对照组(control组);LPS组(终浓度1 μg/mL,刺激6 h);LPS+黄芩苷低剂量组(L-Ba组):用终浓度为10 μmol/L黄芩苷预处理12 h后,然后加入终浓度为1 μg/mL的LPS刺激6 h;LPS+黄芩苷中剂量组(M-Ba组):用终浓度为20 μmol/L黄芩苷预处理12 h后,然后加入终浓度为1 μg/mL的LPS刺激6 h;LPS+黄芩苷低剂量组(H-Ba组):用终浓度为30 μmol/L黄芩苷预处理12 h后,然后加入终浓度为1 μg/mL的LPS刺激6 h。每组8个样本。
1.3 CCK-8法检测细胞存活率胰酶消化后收集细胞,每组细胞以1×104个/ml浓度接种于96孔培养板中,培养24 h后经过上述各组不同的处理,然后每孔加入CCK溶液10 μL,37 ℃孵育4 h,450 nm波长检测吸光度值(A),计算细胞相对存活率。存活率=[(A实验组-A空白孔)/(A对照孔-A空白孔)]×100%。
1.4 细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达量的检测各组细胞经过不同的处理后,收集经处理的细胞培养液,1000 r/min离心5 min,分离上清液。采用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-6和IL-1β,应用酶标仪于450 nm波长处读数测定结果。
1.5 H9C2细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38 MAPK、p-p38 MAPK、IκBα、p-IκBα蛋白表达的检测常规提取细胞胞浆及胞核蛋白,采用BCA法检测蛋白浓度,制备上样缓冲液,蛋白上样量为15 μg,制备SDS-PAGE分离胶(12%),浓缩胶(5%),在浓缩胶中80 V电泳,当样品进入分离胶时,将电压调至120 V,电泳60 min,转膜,封闭120 min,加入一抗和内参照抗体,4℃孵育过夜;加入山羊抗兔抗体,37℃孵育1 h,洗膜后ECL试剂盒显影,用Image Lab软件对条带进行分析,计算出吸光度值,用目标带与内参的吸光度比值来衡量表达情况,作为蛋白的相对表达量。
1.6 统计学方法实验结果数据若服从正态分布则以以均数±标准差(Mean±SD)表示,应用SPSS 23.0统计软件进行数据处理,两组样本比较采用独立样本t检验,多组均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 黄芩苷提高脂多糖诱导的H9C2心肌细胞存活率用不同浓度黄芩苷预处理12 h后,然后加入终浓度为1 μg/mL的LPS刺激6 h。每组8个样本。CCK-8检测各样本的存活率。结果如图 1所示,对照组心肌细胞存活率为(93.67±1.453)%,而LPS刺激组存活率为(60.33±2.603)%,与对照组相比,LPS组存活率明显降低(P=0.0004)。采用单因素方差分析,黄芩苷干预组各组间存活率比较差异有统计学意义(P=0.0287)。与LPS组相比,黄芩苷干预组心肌细胞存活率明显升高,且在H-Ba组时存活率升高最明显,差异有统计学意义(P=0.0016)。
2.2 黄芩苷减轻脂多糖诱导的H9C2心肌细胞炎症损伤经过各组不同处理,检测H9C2心肌细胞炎症因子的表达,如图 2所示,对照组H9C2心肌细胞IL-6表达量为(49.33±2.42)pg/mL,LPS组为(68.67±0.88)pg/mL。与对照组相比,LPS组的IL-6表达量明显升高(P=0.0015)。采用单因素方差分析,黄芩苷干预组各组间IL-6比较差异有统计学意义(P=0.0136)。与LPS组相比,黄芩苷干预组IL-6明显降低,且在H-Ba组时降低最明显,差异有统计学意义(P=0.0007)。如图 3所示,对照组H9C2心肌细胞TNF-a表达量为(86.33±1.85)pg/mL,LPS组为(139.30±4.87)pg/mL。与对照组相比,LPS组的TNF-a表达量明显升高(P=0.0005),采用单因素方差分析,黄芩苷干预组各组间TNF-α比较差异有统计学意义(P=0.0056)。与LPS组相比,黄芩苷干预组TNF-a明显降低,且在H-Ba组时降低最明显,差异有统计学意义(P=0.001)。如图 4所示,对照组H9C2心肌细胞IL-1β表达量为(28.67±4.66)pg/mL,LPS组为(51.33±2.40)pg/mL。与对照组相比,LPS组的IL-1β表达量明显升高(P=0.0125),采用单因素方差分析,黄芩苷干预组各组间IL-1β比较差异有统计学意义(P=0.0151)。与LPS组相比,黄芩苷干预组IL-1β明显降低,且在H-Ba组时降低最明显,差异有统计学意义(P=0.0002)。
2.3 黄芩苷抑制脂多糖诱导的H9C2心肌细胞NF-κB活化
经过各组不同处理,检测H9C2心肌细胞p-NF-κB p-65、NF-κB p-65的蛋白表达水平。如图 5所示,与对照组相比,LPS组p-NF-κB p-65蛋白水平明显升高(P=0.0004)。采用单因素方差分析,黄芩苷干预组各组间p-NF-κB p-65蛋白比较差异有统计学意义(P=0.0039)。与LPS组相比,黄芩苷干预组p-NF-κB p-65蛋白表达明显降低,且在H-Ba组时降低最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。而各组间NF-κB p-65总蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。
2.4 黄芩苷抑制脂多糖诱导的H9C2心肌细胞p-p38 MAPK蛋白表达经过各组不同处理,检测H9C2心肌细胞p-p38 MAPK、p38 MAPK的蛋白表达水平。如图 6所示,与对照组相比,LPS组p-p38 MAPK蛋白水平明显升高(P=0.0023)。采用单因素方差分析,黄芩苷干预组各组间p-p38 MAPK蛋白比较差异有统计学意义(P=0.0294)。与LPS组相比,黄芩苷干预组p-p38 MAPK蛋白表达明显降低,且在H-Ba组时降低最明显,差异有统计学意义(P=0.0032)。而各组间p38 MAPK总蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 黄芩苷抑制脂多糖诱导的H9C2心肌细胞p-IκBα蛋白表达经过各组不同处理,检测H9C2心肌细胞p-IκBα、IκBα的蛋白表达水平。如图 7所示,与对照组相比,LPS组p-IκBα蛋白水平升高(P=0.0031)。采用单因素方差分析,黄芩苷干预组各组间p-IκBα蛋白比较差异有统计学意义(P=0.0141)。与LPS组相比,黄芩苷干预组p-IκBα蛋白表达明显降低,且在H-Ba组时降低最明显,差异有统计学意义(P=0.0039)。与对照组相比,LPS组IκBα蛋白水平降低(P=0.011)。采用单因素方差分析,黄芩苷干预组各组间IκBα蛋白比较差异有统计学意义(P=0.0057)。与LPS组相比,黄芩苷干预组IκBα蛋白表达明显升高,且在H-Ba组时升高最明显,差异有统计学意义(P=0.0025)。
3 讨论脓毒症是临床常见的急危重症,进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征,心肌损伤是脓毒症和脓毒性休克的常见并发症[2],有统计数据显示,大约有40%-50%的脓毒症患者出现心功能不全,其中出现心力衰竭者占7%[9]。脓毒症心肌损伤发病机制复杂。脓毒症时机体可过度产生炎性因子,包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6[10]。这些炎症因子对心脏的损伤不仅通过激活神经鞘磷脂酶,抑制钙的转运、刺激组织性NO的产生;还通过刺激心肌水解酶等,将主要的心肌收缩蛋白降解,从而影响心脏收缩功能[11]。
NF-κB是多种损伤反应基因的多效调节因子。在静息细胞中, 它常与其抑制性蛋白I-κB结合存在于胞浆内,各种刺激引起I-κB磷酸化并被降解、NF-κB被激活, 通常以p65/p50异二聚体的形式结合至DNA上的相应位点,调控下游含有NF-κB结合序列的靶基因的转录表达,这些基因包括了TNF-α、IL-1β、iNOS等相关的基因[12]。p38-MAPK是MAPK家族成员参与多种细胞内信号转导[13]。p38-MAPK被激活后可磷酸化I-κB,导致I-κB被降解、I-κB与NF-κB解聚、NF-κB被激活并发生核转位。有研究表明LPS可通过NF-κB信号通路介导促炎因子的生成和分泌,导致心肌细胞炎症反应和心肌功能紊乱。本研究参照以前的LPS剂量和刺激时间诱导心肌细胞,模拟脓毒症心肌损伤体外模型,研究发现LPS诱导后H9C2心肌细胞存活率降低,IL-6、IL-1β及TNF-α表达水平升高,p-NF-κB p65、p-p38 MAPK、p-IκBα蛋白水平升高,IκBα蛋白水平降低,因此可以推测LPS诱导后H9C2心肌细胞p38 MAPK通路激活,磷酸化I-κB,导致I-κB被降解,I-κB与NF-κB解聚、NF-κB被激活并发生核转位,引起下游炎症因子表达升高。
黄芩苷是从植物黄芩中提纯出来的一种黄酮类化合物,具有广泛的药理特性,如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抑菌、抗凋亡等。黄芩苷还能通过抑制心肌重构有效缓解心脏肥大、纤维化的发展。然而,黄芩苷在LPS诱导的心肌损伤中潜在的保护作用及其分子机制研究较少,因此,本研究主要探讨黄芩苷对LPS引起的H9C2心肌细胞炎症的保护作用并探讨其可能机制。在本研究中,检测指标时间点为LPS刺激后6 h,而黄芩苷因脂溶性、水溶性差,作用细胞起效时间慢,因此在本文中通过提前12 h预处理,然后再用LPS刺激6 h后检测指标。本研究发现黄芩苷干预组H9C2心肌细胞存活率升高,IL-6、IL-1β及TNF-α表达水平降低,p-NF-κB p65、p-p38 MAPK、p-IκBα蛋白水平降低(P<0.05),IκBα蛋白水平升高。笔者推测黄芩苷可能通过抑制NF-κB、p38 MAPK的激活来减轻LPS诱导的心肌细胞炎症反应。最近也有研究发现黄芩苷能通过抑制NF-κB、p38 MAPK通路的激活减轻氧化应激和炎症反应从而减轻动脉粥样硬化,这与本实验黄芩苷的作用机制基本一样。黄芩苷对心脏功能的影响也有报道,有研究发现黄芩苷能减轻慢性压力超负荷小鼠心脏功能障碍和心肌重塑。也有研究报道黄芩苷对再灌注心肌细胞损伤具有保护作用,其机制可能通过抑制线粒体膜通道转换孔开放从而减少自噬的相关诱导因素发挥作用。黄芩苷作用靶点较多,但主要的作用是抗炎作用,因此本研究选择已报道了NF-κB和p38 MAPK通路,研究结果也证实了黄芩苷确实能抑制NF-κB、p38 MAPK通路,但本研究并未通过阻断NF-κB、p38 MAPK通路证实这条通路是黄芩苷作用的主要通路,所以研究有待进一步深入。
[1] | Freund Y, Lemachatti N, Krastinova E, et al. Prognostic accuracy of Sepsis-3 criteria for in-hospital mortality among patients with suspected infection presenting to the emergency department[J]. JAMA, 2017, 317(3): 301-308. DOI:10.1001/jama.2016.20329 |
[2] | Vincent JL, Marshall JC, Namendys-Silva SA, et al. Assessment of the worldwide burden of critical illness: the intensive care over nations (ICON) audit[J]. Lancet Respir Med, 2014, 2(5): 380-386. DOI:10.1001/jama.2016.20329 |
[3] | Lv XX, Wang HD. Pathophysiology of sepsis-induced myocardial dysfunction[J]. Mil Med Res, 2016, 3: 30. DOI:10.1186/s40779-016-0099-9 |
[4] | Pang M, Yuan YY, Wang D, et al. Recombinant CC16 protein inhibits the production of pro-inflammatory cytokines via NF-κB and p38 MAPK pathways in LPS-activated RAW264.7 Macrophages[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2017, 49(5): 435-443. DOI:10.1093/abbs/gmx020 |
[5] | Shi XQ, Fu YJ, Zhang SS, et al. Baicalin attenuates subarachnoid hemorrhagic brain injury by modulating blood-brain barrier disruption, inflammation, and oxidative damage in mice[J]. Oxid Med Cell Longev, 2017, 2017: 1401790. DOI:10.1155/2017/1401790 |
[6] | Chen HG, Xu YF, Wang JZ, et al. Baicalin ameliorates isoproterenol-induced acute myocardial infarction through iNOS, inflammation and oxidative stress in rat[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(9): 10139-10147. |
[7] | Zhu J, Wang J, Sheng Y, et al. Baicalin improves survival in a murine model of polymicrobial sepsis via suppressing inflammatory response and lymphocyte apoptosis[J]. PLoS One, 2012, 7(5): e35523. DOI:10.1371/journal.pone.0035523 |
[8] | Zhu YP, Fu YX, Lin HR, et al. Baicalin Inhibits Renal Cell Apoptosis and Protects AgainstAcute Kidney Injury in Pediatric Sepsis[J]. Med Sci Monit, 2016, 22: 5109-5115. DOI:10.12659/MSM.899061 |
[9] | Esper AM, Martin GS. Extending international sepsis epidemiology: the impact of organdysfunction[J]. Critical Care, 2009, 13(1): 1-3. DOI:10.1186/cc7704 |
[10] | 卞佳兰, 莫清飞, 罗欢, 等. 生长停滞特异性蛋白6对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护研究[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(2): 161-167. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2017.02.008 |
[11] | 张晓凡, 李莉. 脓毒症心肌损伤机制研究及治疗进展[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(3): 339-341. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.027 |
[12] | Sumner RP, de Motes CM, Veyer DL, et al. Vaccinia virus inhibits NF-κB-dependent gene expression downstream of p65 translocation[J]. J Virol, 2014, 88(6): 3092-3102. DOI:10.1128/JVI.02627-13 |
[13] | Huang X, Zeng Y, Jiang YJ, et al. Lipopolysaccharide-binding protein downregulates fractalkine through activation of p38 MAPK and NF-κB[J]. Mediators Inflamm, 2017, 2017: 9734837. DOI:10.1155/2017/9734837 |