百草枯（paraquat，PQ）是一种对人类等哺乳动物有剧毒的化合物，我国尽管已经限制了PQ液体剂型的销售，但仍存在已售农药的中毒问题以及PQ与其他农药混配导致的中毒情况^[1]。已知PQ摄入人体后，主要在肺中聚集，引起急性肺损伤和快速肺纤维化，病死率极高^[2]。研究发现，上皮间充质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程中参与了PQ引起的肺纤维化，表现为小鼠肺组织内肺泡上皮细胞标记物SPC与间充质细胞标记物α-SMA共表达，可能是PQ致快速肺纤维化的机制之一^[3]。N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-cysteine，NAC）具有清除自由基的特性，是临床上常用的抗氧化剂，被认为是一种安全且耐受良好的辅助药物^[4]。NAC是体内还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的前体，具有抗氧化和强效抗炎作用^[5]。在肾、肝、肾上腺、肺、脑组织中，NAC通过半胱氨酸载体介导机制实现主动转运^[6]。NAC在修复过程中具有增强细胞增殖、促进细胞迁移和创面愈合等多种功能^[7]。在大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）中，NAC可以通过抗氧化和增强线粒体功能减轻PQ引起的细胞自噬^[8]。另外，NAC可通过激活Wnt信号通路减轻PQ所致的神经毒性^[9]。中国专家共识^[10]和韩国指南^[11]均建议PQ中毒患者使用NAC治疗。然而，NAC在PQ所致肺损伤及肺纤维化中的保护机制尚未完全阐明。本研究通过体外细胞实验，观察TGF-β1, EMT相关指标E-cad和α-SMA在PQ致A549细胞转分化过程中的改变和NAC在此过程中的保护作用，进而为临床PQ中毒致肺纤维化的治疗提供理论依据和潜在治疗靶点。

人非小细胞肺癌细胞（A549）购于中国科学院细胞库，A549细胞在培养箱（37 ℃、含5% CO₂）中，按2×10³/mL的密度接种，培养在含10%胎牛血清（Sciencell，美国）的1640培养基（Gibco，美国）中，待细胞贴壁后，用不同浓度（10、30、50 μmol/L）PQ持续刺激A549细胞0、2、4和6 d。实验中所用A549细胞均为生长状态良好的对数生长期细胞。

A549细胞按8×10³/mL的密度接种，24 h后，10 mmol/L NAC孵育2 h，应用30 μmol/L PQ刺激A549细胞4 d。

待造模完成后，将培养皿置于光学显微镜（Nikon DS-U3）下观察不同条件下A549细胞形态学改变，NIS-Elements软件拍照。

在A549细胞中加入1 mL RNAiso Plus（TaKara，日本），加入200 μL氯仿充分震荡后，室温静置5 min，离心（12 000 g，4℃，15 min）取上清，在上清中加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10 min，离心（12 000 g，4℃，15 min）弃上清，加入75 %乙醇，轻微震荡后离心（7 500 g，4 ℃，5 min）弃上清，静置10 min待乙醇挥发后加入适量DEPC水溶解RNA。按照PrimeScript^TM RTMaster Mix（TaKara，日本）试剂盒说明书进行逆转录，按照SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ（TaKara，日本）试剂盒说明书进行RT-qPCR。RT-qPCR过程中所有引物均由上海捷瑞公司设计，由南京擎科生物科技有限公司合成（表 1）。根据溶解曲线和扩增曲线得知引物特异性和扩增效率。结果计算和分析以GAPDH作为内参基因采用2-^ΔΔCT法。

在A549细胞中加入适量ripa（sigma，美国）充分裂解20 min后离心（12 000 r/min，4 ℃，10 min），取上清，测定蛋白浓度（BCA法），加入1/4（v/v）的上样缓冲液，混匀后充分变性蛋白（100 ℃，5 min）。后将含有20 μg总蛋白的蛋白样品加入至加样孔中进行SDS-PAGE电泳。当溴酚蓝到达胶的底端处附近时结束电泳，使用Bio-Rad标准湿式转膜装置转膜（300 mA，60 min，冰浴）至0.2 μM的PVDF微孔膜（Millipore，美国）。转模结束后，将PVDF膜放置在TBST中，漂洗2 min，后用封闭液（含5 %脱脂奶粉的TBST）室温封闭1 h。封闭结束后，按照相应比例用稀释液（含5 %脱脂奶粉的TBST）稀释一抗（E-cadherin，CST #14472，1:1 000；α-SMA，Bioss bs-10196R，1:5 000；TGF-β，CST #3711，1:1 000；β-tubulin，Selleck A5032，1:1 000），4 ℃轻微摇晃孵育过夜。用TBST洗涤PVDF膜（5 min×3次）。后用封闭液稀释二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（Jacksonimmuno，美国），室温轻微振荡孵育1 h，用TBST洗涤PVDF膜（5 min×3次）。将发光液均匀滴到PVDF膜上，置于Bio-rad凝胶成像系统成像，成像结果使用Image J软件扫描分析灰度值。

运用Graphpad Prime 6软件进行数据统计分析。本实验数据经收集整理后以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组数据比较选择单因素方差分析（One-Way ANOVA）检验，以P＜0.05差异具有统计学意义。

分别应用10、30、50 μmol/L PQ持续刺激A549细胞2、4、6 d。收获细胞，检测EMT指标E-cadherin和α-SMA的蛋白表达水平。如图 1所示，10 μmol/L PQ时，E-cadherin和α-SMA的蛋白表达水平均差异无统计学意义。30 μmol/L PQ时，与对照组相比，α-SMA的蛋白水平表达在4 d时显著升高，E-cadherin的蛋白水平表达显著下降，证明A549细胞发生了EMT。50 μmol/L PQ时，A549细胞在PQ刺激6 d时死亡，故无法检测。但检测2 d和4 d的蛋白时，发现E-cadherin和α-SMA的蛋白表达水平在2 d时差异无统计学意义，在4 d时都显著下降。因此，本实验选择30 μmol/L PQ刺激A549细胞4 d建立EMT模型。

A：10 μmol/L PQ分别暴露A549细胞2、4、6 d E-cadherin和α-SMA蛋白表达结果及统计图；B：30 μmol/L PQ分别暴露A549细胞2、4、6 d E-cadherin和α-SMA蛋白表达结果及统计图；C：50 μmol/L PQ分别暴露A549细胞2，4 d E-cadherin和α-SMA蛋白表达结果及统计图；与对照组比较，aP < 0.05，bP < 0.01 图 1 PQ浓度梯度和时间梯度暴露对A549细胞E-cadherin，α-SMA蛋白水平的影响 Fig 1 E-cadherin and α-SMA protein expression mediated by dose-dependent and time-dependent manner of PQ

图选项

如图 2所示，预孵10 mM NAC 2 h后，与PQ组相比，NAC+PQ组的E-cadherin蛋白水平表达显著升高，α-SMA的蛋白水平表达显著下降。提示NAC可以有效逆转PQ刺激A549细胞产生的EMT。

10 mmol/L NAC预孵育2 h对PQ暴露A549细胞E-cadherin和α-SMA蛋白表达结果及统计图；与对照组比较，aP < 0.05，bP < 0.01；与PQ组比较，cP < 0.05，dP < 0.01 图 2 2 NAC预处理对PQ诱导A549细胞EMT过程的影响 Fig 2 Changes of NAC pretreatment in the process of PQ-induced EMT in A549 cells

图选项

如图 3所示，与对照组相比，TGF-β1的蛋白水平表达在4 d时显著升高。预孵10 mmol/L NAC 2 h后，PQ染毒4 d，与PQ组相比，TGF-β1的蛋白水平表达显著下降，提示NAC通过抑制TGF-β1的表达抑制了PQ刺激A549细胞产生的EMT。

A：30 μmol/L PQ在不同时间点暴露于A549细胞TGF-β1蛋白水平的表达趋势; B：10 m mol/L NAC预孵2 h，30 μmol/L PQ刺激A549细胞4 d TGF-β1蛋白水平的表达趋势; 与对照组比较，aP < 0.05，bP < 0.01；与PQ组比较，cP < 0.05，dP < 0.01 图 3 TGF-β1蛋白水平的表达趋势 Fig 3 TGF-β1 protein expression

图选项

光镜下形态学结果表明，对照组A549细胞表现出鹅卵石样的上皮细胞外观特征，PQ组A549细胞表现出纺锤形的间质细胞样外观特征，也证明A549细胞发生了EMT。与PQ组相比，NAC+PQ组的细胞形态仍保持上皮细胞鹅卵石样的形态，纺锤形的间质样细胞形态的数量明显减少，表明PQ引起的EMT被部分逆转。提示NAC能够有效逆转在PQ刺激A549细胞引起的EMT, 见图 4。

图 4 A549细胞形态学改变 Fig 4 morphological changes of A549 cells

图选项

本研究结果表明，PQ作用于A549细胞可以引起EMT。TGF-β1参与了A549细胞暴露于PQ产生的EMT，NAC的应用可以逆转EMT。PQ可以诱导A549细胞EMT的发生。本研究表明30μmol/L PQ持续刺激A549细胞4 d诱导细胞发生EMT。6 d时，EMT的两个主要标记蛋白——E-cadherin和α-SMA同时下降，意味着细胞在PQ的持续刺激过程中，由于PQ的毒性作用细胞死亡^[2]。同时，形态学显示PQ暴露4 d，A549细胞数量有所减少，这可能是由于EMT过程中细胞周期进程的短暂衰减所致^[12-13]。

PQ被人体摄入后，通过氧化应激机制产生毒性作用，主要引起呼吸衰竭而死亡^[1-2]。临床上对PQ中毒的创新治疗主要体现在抗氧化剂的应用上^[11]。PQ主要在肺部积聚，尤其是在人支气管上皮细胞以及肺泡I型和Ⅱ型上皮细胞中，导致急性肺损伤和肺纤维化^[14]。多项研究表明，TGF-β可以诱导细胞产生EMT^[15]。本实验结果进一步证明PQ诱导TGF-β1的过表达引起了A549细胞EMT的发生。

谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，是活细胞中最丰富的非蛋白硫醇，其水平通常被用作判断细胞抗氧化能力的指标^[16]。研究表明，在PQ处理的大鼠肺组织中，谷胱甘肽的水平显著降低^[17]。谷胱甘肽的水平与体内抗氧化作用密切相关。而且，在谷胱甘肽过氧化物酶转移酶敲除的大鼠中发现，PQ对该敲除鼠的毒性较野生型大鼠显著增加，但谷胱甘肽过氧化物酶可以有效抑制PQ对该敲除大鼠产生的毒性作用，表明谷胱甘肽过氧化物酶在PQ中毒的保护中起到关键性作用^[11]。

急性PQ中毒后立即产生大量的活性氧，因此应静脉注射抗氧化剂，乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽作为常用的抗氧化剂，由于缺乏药代动力学数据，乙酰半胱氨酸抑制活性氧的最佳浓度仍未可知。根据经验，50~70 mg/kg乙酰半胱氨酸静脉注射是安全的。在体外实验中发现，乙酰半胱氨酸抑制活性氧呈现明显的剂量依赖性，10 μM的乙酰半胱氨酸可以抑制约50 %由PQ引起的活性氧^[11]。

NAC可以影响与氧化还原相关的细胞信号和转录通路，如PI3K/Akt，NF-κB，MAPK通路。氧化应激诱导的损伤通过激活信号通路导致生长停滞和细胞凋亡，NAC可以有效抑制此过程从而促进细胞的生长和存活，并能够减少细胞促炎因子的释放。而且，NAC作为一种黏液溶解剂可以降低痰液的黏度，使痰液液化，更容易咳出。这些作用可能在NAC的保护机制中发挥了重要的作用。本研究证明NAC可以显著抑制PQ暴露引起的EMT。

细胞抗氧化的主要机制是由过氧化物歧化酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶提供的酶，但目前尚无有效方法提高这些酶的活性。尽管在循环中可以检测到自由基，但是PQ中毒导致活性氧的产生是在细胞内，而不是细胞外^[16]。例如羟自由基最初在细胞内生成，透过细胞膜扩散到细胞外。因此，最理想的抗氧化剂应可以透过细胞膜进入细胞内，但是，大部分抗氧化剂对细胞膜的通透性较低，如蛋白巯基，抗坏血酸和维生素E等。生理状态下，NAC可以透过细胞膜^[6]。氧化还原循环，即肺部被供给大量电子和氧，这个过程是持续的。因此理论上不应该停止应用最佳剂量的抗氧化剂，直到氧化还原中断。然而，临床上确定抗氧化剂的最佳剂量，且持续应用高剂量的抗氧化剂相对困难^[11]。动物实验可能可以进一步认证抗氧化剂的有效剂量。