中华急诊医学杂志  2019, Vol. 28 Issue (1): 25-29
心脏骤停大鼠自主循环恢复后心肌损伤的特点
李恒杰1 , 毛慧2 , 蔡文伟1 , 魏红艳3 , 戴刚3 , 卢远征3 , 黎博3 , 廖晓星3     
1 浙江省人民医院,杭州医学院附属人民医院急诊科 310014;
2 浙江省人民医院,杭州医学院附属人民医院麻醉科 310014;
3 中山大学附属第一医院急诊科 广州,510080
摘要: 目的 明确心脏骤停(cardiac arrest, CA)大鼠自主循环恢复(restoration of spontaneous circulation, ROSC)后心肌损伤的特点及其机制。方法 42只雄性Wistar大鼠随机(随机数字法)分为复苏后(post resuscitation, PR)4 h组、PR 24 h组、PR 48 h组及假手术(sham)组。经皮电刺激心外膜诱导室颤建立大鼠CA模型,CA 6 min后开始心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation, CPR)。各组动物至观察时间点行超声心动图检测心功能,行正电子发射型计算机断层显像检测心肌葡萄糖代谢最大标准化摄取值(maximum standardized uptake value, SUVmax),测线粒体通透转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)开放程度及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP),并通过电镜观察心肌超微结构。结果 PR 4 h出现心功能不全,左室射血分数、心输出量下降(均P < 0.01),舒张期左室后壁增厚(P < 0.01),舒张末左室容量变小(P < 0.05),PR 48 h心超参数与sham组比较差异无统计学意义(P > 0.05);与sham组相比,PR 4 h组心肌SUVmax升高,线粒体吸光度下降明显,MMP降低,差异有统计学意义(均P < 0.01),PR 48 h组上述参数与sham组比较差异无统计学意义(均P > 0.05);PR 4 h及PR 24 h组心肌线粒体肿胀,线粒体嵴稀疏,但心肌超微结构完整。结论 CA/ROSC后发生复苏后心功能不全,但ROSC后48 h受损的心功能可完全恢复,其原因可能与心肌损伤为可逆性,线粒体功能和结构逐渐恢复有关。
关键词: 心脏骤停     心肺复苏     复苏后心功能不全     葡萄糖代谢     线粒体通透转换孔     线粒体膜电位    
The characteristics of myocardial injury in rats resuscitated from cardiac arrest
Li Hengjie1 , Mao Hui2 , Cai Wenwei1 , Wei Hongyan3 , Dai Gang3 , Lu Yuanzheng3 , Li Bo3 , Liao Xiaoxing3     
1 Emergency Department, Zhejiang Provincial People's Hospital, People's Hospital of Hangzhou Medical College, Hangzhou 310014, China;
2 Department of Anesthesiology, Zhejiang Provincial People's Hospital, People's Hospital of Hangzhou Medical College, Hangzhou 310014, China;
3 Emergency Department, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sun University, Guangzhou 510080, China
Abstract: Objective To investigate the characteristics of myocardial injury and its underlying mechanism in rats resuscitated from cardiac arrest. Methods Forty-two male Wistar rats were randomly(random number) assigned into the post-resuscitation (PR) 4 h, PR 24 h, PR 48 h, and sham groups. Ventricular fibrillation was induced by transcutaneous electrical epicardium stimulation and untreated for 6 min, followed by cardiopulmonary resuscitation (CPR). Myocardial function, glucose metabolism, myocardial ultrastructure, the status of mitochondrial permeability transition pore (MPTP) and mitochondrial membrane potential (MMP) were evaluated at different time points. Results Myocardial dysfunction was found at 4 h after restoration of spontaneous circulation (ROSC). The ejection fraction and cardiac output were decreased (all P < 0.01), the diastole left ventricular posterior wall became thicker (P < 0.01), and the end-diastolic volume was reduced (P < 0.05). However, cardiac function was recovered almost completely at 48 h after ROSC. The PR 4 h group had a higher SUVmax, a more obvious decreased absorbance, and a lower MMP than the sham group (all P < 0.01), but no statistically significant differences were noted between the PR 48 h group and the sham group (P > 0.05). At 4 h and 24 h after ROSC, the mitochondria was swollen and the mitochondrial crista was sparse, but the myocardial ultrastructure was complete. Conclusions Post resuscitation myocardial dysfunction occurs after ROSC and the myocardial dysfunction is completely reversible at 48 h after ROSC, which may be related to the reversibility of myocardial injury and the gradual recovery of mitochondrial structure and function.
Key words: Cardiac arrest     Cardiopulmonary resuscitation     Post resuscitation myocardial dysfunction     Glucose metabolism     Mitochondrial permeability transition pore     Mitochondrial membrane potential    

随着心肺复苏(cardio-pulmonary resuscitation, CPR)技术的普及和发展,心脏骤停(cardiac arrest, CA)患者自主循环恢复(restoration of spontaneous circulation, ROSC)率明显提高,但在多数国家和地区患者出院存活率仍不足10%[1-2]。复苏后心功能不全(post resuscitation myocardial dysfunction, PRMD)发生率高达45%~60%,会加剧血流动力学障碍、加重脑缺血损伤,是ROSC后患者早期死亡的重要原因[3-4]。PRMD病理机制不同于心肌梗死后心肌坏死和重构引起的心功能障碍[5],本文拟对CA/ROSC后心肌损伤的特点进行研究。

1 材料与方法 1.1 动物准备

本实验获中山大学动物伦理委员会批准。42只健康成年雄性Wistar大鼠,体质量300~350 g,由中山大学实验动物中心提供。动物购入后在SPF级动物房饲养1周,实验前12 h禁食不禁水。动物麻醉采用戊巴比妥钠(Sigma公司,美国)30 mg/kg腹腔内注入,酌情给予1/3的首剂量维持麻醉状态。

1.2 动物分组

随机数字法将大鼠随机分为4组,分别是复苏后(post-resuscitation, PR)4 h组、PR 24 h组、PR 48 h组(均n=12)及假手术组(sham,n=6)。

1.3 手术操作及建立大鼠CA模型

麻醉成功后,以14 G鞘管经口气管插管,接小动物呼吸机(Harvard Apparatus, 美国),通气频率70次/min,潮气量12 mL/kg。连续Ⅱ导联心电监护,解剖分离股动静脉,24 G留置针穿刺,静脉管用于给药,动脉管监测动脉血压。4通道生理信号采集分析系统(SantaBarbara, 美国)记录血压、心电信息。调整电热毯温度使肛温维持在(36.5±0.5)℃。采用经皮电刺激心外膜诱发室颤建立大鼠CA模型[6],室颤持续6 min后进行CPR,纯氧机械通气,通气频率70次/min,同时进行胸外按压,按压频率200次/min,按压深度为胸廓前后径1/3,2 min后进行除颤,每3 min予0.02 mg/kg肾上腺素静推,如此周而复始直至ROSC。ROSC定义为平均动脉压(mean arterial pressure,MAP) > 60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)并持续10 min以上,复苏10 min无效者放弃复苏。

1.4 术后监测与取材

术后监测并机械通气至ROSC 2~3 h,动物拔管回笼。各组动物分别于ROSC 4 h、24 h和48 h行超声心动图(VISUALSONICS Vevo2100,加拿大)检测射血分数(ejection fraction, EF)、心输出量(cardiac output, CO)、舒张期左室后壁(diastole left ventricular posterior wall, LVPWd)和舒张末左室容量(end-diastolic volume, EDV),PET/CT(Siemens Inveon,德国)检测最大标准化摄取值(maxmum standardized uptake value, SUVmax)均值,后安乐死(过量麻醉)剪取心脏,取左心室组织按线粒体提取试剂盒(北京普利莱)步骤提取心肌线粒体。

1.5 PET/CT检查

经股静脉置管注入18F-FDG(4.25 MBq/kg),注射后40 min开始扫描。PET图像以三维有序子集最大期望值法(OSEM-3D)重建。以IRW4.1软件对大鼠心尖部、左室前壁及左室后壁对感兴趣区域(region of interest, ROI)进行勾画,勾画直径为3 mm圆形区域。心肌摄取FDG值取心尖、左室前后壁SUVmax均值,SUV=感兴趣区域峰值kBq/mL/(注射放射性强度×体质量克重)。以SUVmax值反映葡萄糖代谢水平[7]

1.6 线粒体通透性转换孔开放程度的测定

以文献报道的方法,线粒体通透转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)的开放采用分光光度计法测定,以线粒体于540 nm处吸光度下降程度间接反映MPTP的开放程度[8]。线粒体加入测定介质(125 mmol/L蔗糖,50 mmol/L KCl,2 mmol/L KH2PO4,10 mmol/L HEPES)内调整线粒体浓度(0.5 mg/mL)制备线粒体反应体系,加入CaCl2(200 μmol/L)诱发线粒体肿胀,每分钟记录吸光度值直至吸光度不再减少(约10 min)。

1.7 线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)的测定

采用JC-1探针(线粒体膜电位检测试剂盒,碧云天),荧光酶标仪(BioTek,美国)检测心肌细胞线粒体膜电位。在线粒体膜电位高时,JC-1聚集在线粒体的基质中形成聚合物,产生红色荧光;而在线粒体膜电位低时JC-1不能聚集,此时JC-1为单体,产生绿色荧光。详细步骤按照试剂盒说明书进行,以红绿荧光的相对比例来反映线粒体膜电位高低。

1.8 心肌超微结构的观察

取3 mm×3 mm×1 mm心尖部组织于2.5%戊二醛溶液中固定,修剪成约1 mm×1 mm×1 mm组织块,常规脱水、浸透、包埋、染色后制成80 nm的超薄切片,电镜(JEOL JEM-1400,日本)下观察心肌组织超微结构。

1.9 统计学方法

采用SPSS 13.0软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示,并进行正态性检验。多组间比较采用单因素方差分析,多样本均数的两两比较采用LSD-t检验;非参数的多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 基本生理参数及复苏指标

各组动物体质量、心率和MAP基线值比较,差异无统计学意义(P > 0.05,表 1);各实验组动物CPR时间、除颤次数、肾上腺素用量及ROSC率的比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。PR 4 h组、PR 24 h组和PR 48 h组各有1只、2只及4只大鼠未存活至观察时间点。

表 1 各组动物基本生理参数及复苏指标 Table 1 Basic physiological parameters and resuscitation related indexes in each group
指标 sham组
(n=6)
PR 4 h组
(n=12)
PR 24 h组
(n=12)
PR 48 h组
(n=12)
体质量(g) 330±14 326±17 326±13 329±15
心率(次/min) 407±18 404±21 401±17 407±20
MAP(mmHg) 89±14 92±13 90±12 90±10
CPR时间(s) - 267±166 252±127 244±132
除颤次数(次) - 2±1 2±1 2±1
肾上腺素(μg) - 14±7 14±6 12±5
ROSC率(只) - 10 11 11
存活(只) 6 9 9 7
2.2 心功能检测

PR 4 h组大鼠EF值较sham组显著下降(P < 0.01,图 1),PR 24 h及PR 48 h组大鼠EF值与sham组比较差异无统计学意义(均P > 0.05);PR 4 h及PR 24 h组大鼠CO较sham组均显著下降(均P < 0.01),且PR 24 h组高于PR 4 h组(P < 0.01),但PR 48 h组与sham组比较差异无统计学意义(P > 0.05);PR 4 h及PR 24 h组大鼠LVPWd较sham组均显著增厚(均P < 0.01),PR 48 h组与sham组比较差异无统计学意义(P > 0.05);PR 4 h及PR 24 h组大鼠EDV较sham组均显著变小(均P < 0.05),PR 48 h组与sham组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。

A:sham组(n=6);B:PR 4 h组(n=9);C:PR 24 h组(n=9);D:PR 48 h组(n=7);E:EF值的比较;F:CO的比较;G:LVPWd的比较;H:EDV的比较;与sham组比较,aP < 0.05和bP < 0.01;与PR 4 h组比较,cP < 0.05和dP < 0.01;与PR 24 h组比较,eP < 0.05 图 1 各组动物射血分数、心输出量、舒张期左室后壁和舒张末左室容量的比较 Figure 1 Comparison of EF, CO, LVPWd and EDV among groups
2.3 心肌SUVmax

PR 4 h及PR 24 h组大鼠心肌SUVmax较sham组均显著升高(均P < 0.01,图 2),PR 24 h组低于PR 4 h组(P < 0.01),PR 48 h组与sham组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。

A:sham组(n=6);B:PR 4 h组(n=9);C:PR 24 h组(n=9);D:PR 48 h组(n=7);E:SUVmax的比较;与sham组比较,aP < 0.01;与PR 4 h组比较,bP < 0.01;与PR 24 h组比较,cP < 0.01 图 2 各组大鼠心肌葡萄糖代谢 Figure 2 Myocardial glucose metabolism of rats in each group
2.4 MPTP开放程度及MMP

加入氯化钙诱发线粒体肿胀后,各组线粒体在540 nm处吸光度均有下降,PR 4 h及PR 24 h组吸光度下降值均高于sham组(均P < 0.01,图 3),PR 24 h组较PR 4 h组下降程度减轻(P < 0.01),PR 48 h组与sham组比较差异无统计学意义(P > 0.05);PR 4 h及PR 24 h组大鼠心肌MMP较sham组均显著下降(均P < 0.05),PR 24 h组高于PR 4 h组(P < 0.05),PR 48 h组与sham组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。

A:MPTP开放程度的比较;B:MMP的比较;与sham组比较,aP < 0.05和bP < 0.01;与PR 4 h组比较,cP < 0.05和dP < 0.01;与PR 24 h组比较,eP < 0.05 图 3 各组大鼠间MPTP开放程度及MMP的比较 Figure 3 Comparison of MPTP and MMP in each group
2.5 心肌超微结构

透射电镜下见,sham组心肌肌原纤维排列有序、Z线明显,线粒体基质致密、嵴排列浓密(图 4);PR 4 h组及PR 24 h组肌原纤维结构形态正常、Z线稍有模糊,线粒体肿胀、基质疏松、嵴排列稀疏,但线粒体被膜完整;PR 48 h组心肌超微结构与sham组相仿。

A:sham组;B:PR 4 h组;C:PR 24 h组;D:PR 48 h组 图 4 电镜下心肌超微结构 Figure 4 Ultrastructure of myocardium under electron microscope
3 讨论

PRMD在ROSC后数分钟即可发生,左室收缩舒张功能均受损,可引起心源性休克进而导致多脏器功能衰竭,这种早期发生的、严重的心功能障碍,可在ROSC后数天至数周内完全恢复[9-10]。Kern等[11]发现在猪的CA模型中,复苏后数小时内EF值、每搏输出量(SV)明显下降,但心功能在复苏后48 h可完全恢复。Laurent等[12]研究显示,对于CA复苏成功的患者,血流动力学不稳定主要表现在ROSC后4~7 h内,表现为心输出量明显降低,而在ROSC 24 h后患者的CO会迅速升高,72 h左右可恢复至正常水平。本研究的6 min CA模型中,ROSC 4 h时心脏收缩舒张功能均明显下降,但48 h时可恢复至正常水平,这也与之前研究中PRMD特点相符[9-12]。这种暂时性心功能障碍提示CA/ROSC后心肌损伤非持续性的损伤或梗死。

越来越多的研究证实MPTP在发生心功能障碍和细胞死亡的过程中发挥重要作用,MPTP开放状态决定细胞的生死存亡[13]。在可逆性损伤的情况下,MPTP一过性开放,活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)过量产生、钙超载引起心肌代谢及功能障碍[14]。若损伤加重,MPTP持续性开放,MMP崩塌、线粒体肿胀破裂,最终引起细胞凋亡或坏死[15]。本研究中,ROSC 4 h时MPTP明显开放、MMP下降,但在48 h时已恢复至正常水平。ROSC 4 h及24 h电镜下见心肌线粒体肿胀、脊稀疏,但结构完整。MPTP一过性开放及心肌超微结构完整也说明心肌的损伤为可逆性。

生理情况下,心肌能量主要来自脂肪酸和葡萄糖代谢,受损心肌脂肪酸代谢下降,而葡萄糖代谢明显增强[16]。Mcnulty等[17]在心肌缺血模型中发现受损心肌葡萄糖代谢为正常心肌的6.6倍;有研究者认为受损心肌对葡萄糖的偏爱是因为葡萄糖产能耗氧更少[18];也有研究者认为葡萄糖酵解增强、产生的能量用以促进内质网对钙的转移、减轻钙超载[19]。本研究的CA模型中,ROSC 4 h心肌葡萄糖代谢为正常心肌5倍,而在48 h时已降至正常水平,ROSC后心肌葡萄糖代谢增强可能是心肌代谢受损、能量产生障碍的代偿反应。

综上所述,本研究证实CA/ROSC后发生PRMD,但ROSC后48 h受损的心功能可完全恢复,其原因可能与心肌损伤为可逆性、线粒体结构功能逐渐恢复有关。然而,本研究采用CA 6 min模型、仅对ROSC后的3个时间点进行研究,有一定局限性。更深入地探讨PRMD的病理机制及心肌损伤特点,将有助于对CA患者进行更好的救治。

参考文献
[1] Lee SY, Song KJ, Shin SD, et al. A disparity in outcomes of out-of-hospital cardiac arrest by community socioeconomic status: A ten-year observational study[J]. Resuscitation, 2018, 126: 130-136. DOI:10.1016/j.resuscitation.2018.02.025
[2] Shao F, Li CS, Liang LR, et al. Incidence and outcome of adult in-hospital cardiac arrest in Beijing, China[J]. Resuscitation, 2016, 102: 51-56. DOI:10.1016/j.resuscitation.2016.02.002
[3] Shiyovich A, Gerovich A, Katz A. Early CPR in out-of-hospital cardiac arrest[J]. N Engl J Med, 2015, 373(16): 1572-1574. DOI:10.1056/NEJMc1509059#SA2
[4] Vancini-Campanharo CR, Vancini RL, Lira C, et al. Cohort study on the factors associated with survival post-cardiac arrest[J]. Sao Paulo Med J, 2015, 133(6): 495-501. DOI:10.1590/1516-3180.2015.00472607
[5] Cahill TJ, Kharbanda RK. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk[J]. World J Cardiol, 2017, 9(5): 407-415. DOI:10.4330/wjc.v9.i5.407
[6] 胡春林, 魏红艳, 廖晓星, 等. 兔室颤心搏骤停模型的建立[J]. 中华急诊医学杂志, 2009, 18(9): 943-947. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2009.09.011
[7] 吴彩军, 李春盛, 杨军, 等. 窒息心脏骤停动物模型中碳酸氢钠对复苏的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(4): 403-407. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.04.015
[8] 李恒杰, 魏红艳, 邓宇斌, 等. 七氟醚对心脏骤停大鼠心肌保护作用的研究[J]. 中华急诊医学杂志, 2016, 25(1): 28-32. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2016.01.008
[9] Chalkias A, Xanthos T. Pathophysiology and pathogenesis of post-resuscitation myocardial stunning[J]. Heart Fail Rev, 2012, 17(1): 117-128. DOI:10.1007/s10741-011-9255-1
[10] Jentzer J, Chonde MD, Dezfulian C. Myocardial dysfunction and shock after cardiac arrest[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015: 314796. DOI:10.1155/2015/314796
[11] Kern KB, Hilwig RW, Rhee KH, et al. Myocardial dysfunction after resuscitation from cardiac arrest: an example of global myocardial stunning[J]. J Am Coll Cardiol, 1996, 28(1): 232-240. DOI:10.1016/0735-1097(96)00130-1
[12] Laurent I, Monchi M, Chiche JD, et al. Reversible myocardial dysfunction in survivors of out-of-hospital cardiac arrest[J]. J Am Coll Cardiol, 2002, 40(12): 2110-2116. DOI:10.1016/s0735-1097(02)02594-9
[13] Kwong JQ, Molkentin JD. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart[J]. Cell Metab, 2015, 21(2): 206-214. DOI:10.1016/j.cmet.2014.12.001
[14] Bernardi P, von Stockum S. The permeability transition pore as a Ca(2+) release channel: new answers to an old question[J]. Cell Calcium, 2012, 52(1): 22-27. DOI:10.1016/j.ceca.2012.03.004
[15] Halestrap AP. What is the mitochondrial permeability transition pore?[J]. J Mol Cell Cardiol, 2009, 46(6): 821-831. DOI:10.1016/j.yjmcc.2009.02.021
[16] Stanley W, Lopaschuk G, Hall J, et al. Regulation of myocardial carbohydrate metabolism under normal and ischaemic conditions. Potential for pharmacological interventions[J]. Cardiovasc Res, 1997, 33(2): 243-257. DOI:10.1016/s0008-6363(96)00245-3
[17] Mcnulty PH, Jagasia D, Cline GW, et al. Persistent changes in myocardial glucose metabolism in vivo during reperfusion of a limited-duration coronary occlusion[J]. Circulation, 2000, 101(8): 917-922. DOI:10.1161/01.cir.101.8.917
[18] Tuunanen H, Engblom E, Naum A, et al. Free fatty acid depletion acutely decreases cardiac work and efficiency in cardiomyopathic heart failure[J]. Circulation, 2006, 114(20): 2130-2137. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.106.645184
[19] Xu KY, Zweier JL, Becker LC. Functional coupling between glycolysis and sarcoplasmic reticulum Ca 2+ transport[J]. Circ Res, 1995, 77(1): 88-97. DOI:10.1161/01.res.77.1.88