2018, Vol. 27
严重创伤，特别是多发伤，常合并有不同程度的骨骼肌损伤，尤其是在挤压伤及挤压综合征中，由于血循环受阻，肌肉组织常常发生进行性坏死，即使解除压迫，继发的骨骼肌缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，I/R）也可致伤情加重[1]。这种缺血后低氧灌注导致组织细胞损伤，当再次恢复正常血供和氧供时，组织细胞的损伤不仅未能恢复，反而进一步加重的现象被称之为氧反常（oxygen paradox）[2-3]。其主要机制为线粒体损伤、细胞内钙超载和氧自由基的过度释放[4]，临床上可表现为肌红蛋白血症、电解质紊乱、酸碱失衡和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[5]。由此可见，如何控制氧反常，减轻恢复正常氧供后对组织造成的危害，避免继发的一系列并发症，成为临床研究的重点目标之一。
实验研究证明，各种缺血缺氧前/后预处理可以对组织损伤起到保护作用[6]，但是对于创伤患者，由于无法预见创伤和实现创伤前预处理，使得后预处理成为改善再灌注损伤的重要手段。同济医院创伤外科利用负压封闭引流（vacuum sealing drainage，VSD）技术，在治疗挤压伤和预防MODS中取得了良好效果[7-8]，但是该技术如何通过局部负压吸引来减轻缺血-再灌注损伤的具体机制尚不明确。因此，本研究拟通过缺血-再灌注损伤动物模型，结合前期实验结果[9-10]，来探讨VSD技术对组织氧分压（oxygen partial pressure，PtO2）、低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α）mRNA和蛋白、以及无氧代谢物乳酸（lactic acid，LA）的影响，以探索其在骨骼肌缺血-再灌注损伤中的保护机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物雄性新西兰兔30只，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，本实验中的饲养与操作均符合《湖北省实验动物管理条例》。
1.2 动物建模将新西兰兔分别称质量后按照150 mg/kg的剂量，耳缘静脉注射盐酸氯胺酮注射液，麻醉成功后固定于操作台。缺血-再灌注损伤模型制备：取实验兔左后腿中部以上的皮肤剃毛消毒后剪开，于大腿根部游离股动静脉并予以保护，大腿中上水平切断所有肌肉，将离断的肌肉进行原位缝合，使左后肢仅通过股动静脉控制血液循环。使用无创伤血管夹阻断股动静脉造成下肢缺血（持续4 h），然后放开血管夹，造成再灌注损伤（持续6 h）。
1.3 实验分组30只实验兔随机（随机数字法）分为3组，即对照组（假手术组）、缺血-再灌注组（I/R组）、VSD干预的缺血-再灌注组（I/R+VSD组），每组10只：①对照组动物仅完成组织游离，不进行左后肢动静脉的夹闭及开放；②I/R组动物完成组织游离后进行左后肢动静脉的夹闭及开放，不进行VSD干预；③I/R+VSD组动物在进行再灌注的同时，对损伤处予以VSD干预。术中负压控制在-125 mmHg（-16.6 kPa）。各组实验结束后将兔用注射水合氯醛法处死，取相应部位组织进行生化指标测定。
1.4 主要仪器、材料和试剂（1）仪器。组织氧分压测量仪（同济医学院生物医学工程实验室、专利号为CN200320128234.1，武汉，中国），便携式负压吸引仪（维斯第公司，武汉，中国），CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司，加州，美国)。
（2）材料。VSD一次性使用负压引流护创材料（维斯第公司，武汉，中国）、特制饲养笼（同济医院实验动物中心，武汉，中国）。
（3）试剂。①实时荧光聚合酶链反应：TRIzol试剂盒（Invitrogen公司，加州，美国）、FSK-100 ReverTra Ace-α-cDNA合成试剂盒（Toyobo公司，大阪，日本）、QPK212 plus SYBR Green real time-PCR master mix-plus-荧光定量PCR试剂盒（Toyobo公司，大阪，日本）；②酶联免疫吸附法：LA检测试剂盒（江莱公司，杭州，中国）；③免疫印迹法：HIF-1α抗体（Novus公司，纽约，美国）。
（4）引物和内参。HIF-1α引物（NM001082782.1）由Prime Premier 5.0软件设计，美国Invitrogen公司合成（编号：15596-026），见表 1。
| 引物名称 | 序列（5'→3'） | 序列大小（bp） | 退火温度（℃） | 循环次数 |
| HIF-1α | 正向：CGAGATCGTGCGGGACAT | 184 | 60 | 35 |
| 反向：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC | ||||
| β-actin | 正向：TGATTTTACCCATCCGTGT | 172 | 60 | 30 |
| 反向：CTTCCAGGTGGCAGACTTTA |
应用组织氧分压测量仪结合传感针，分别记录建模前、建模后和再灌注10 h内各时间点下肢骨骼肌PtO2数值的变化。因模型动物的个体差异，以及传感针安放位置存在一定误差（I/R+VSD组为VSD敷料区域皮下0.5 cm，对照和I/R组为相应区域皮下0.5 cm），遂以各组建模前测得的PtO2为基础值，计算各组建模后测得值的比率，从而体现PtO2的变化情况，以尽可能消除组内误差的影响。测量过程中，应避免过度刺激实验兔，引起剧烈活动影响测量结果。
1.6 样本取材和检测方法（1）HIF-1α mRNA组织标本：分别于建模前、再灌注前、实验结束后3个时间点在损伤肌肉区域取材，严格按照试剂盒说明操作，一次性提取RNA、反转录、循环后测定和计算HIF-1α mRNA样本实际Ct值，根据各时间点的扩增倍数比较HIF-1α mRNA表达的变化。
（2）HIF-1α组织标本：本实验引入β-actin作为内参，采用免疫印迹法检测HIF-1α蛋白的表达。分别于再灌注前、再灌注后3 h和实验结束后3个时间点在损伤肌肉同一区域取材，取漂洗干净的骨骼肌组织，提取总蛋白进行15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至硝酸纤维素膜上，封闭过夜后依次加入一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗，使用化学发光法进行显色。
（3）LA组织标本：各组实验结束后，将兔处死，使用冰去离子水对获取的兔左后肢骨骼肌组织进行冲洗并进行匀浆处理，使用低温离心机以3 000 r/min离心10 min，取上清液以酶联免疫吸附法进行LA的检测，严格按照试剂盒说明操作。
（4）LA血液标本：分别于建模前、再灌注前、实验结束后3个时间点，于兔耳缘静脉抽取外周静脉血1 mL，使用低温离心机以3 000 r/min离心5 min，取上清液以酶联免疫吸附法进行LA的检测，严格按照试剂盒说明操作。
1.7 统计学方法所有数据使用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。统计分析前先行数据正态性及方差齐性检验；多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较用LSD-t法（确定方差齐性）或Tamhane's T2法（未确定方差齐性）；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 骨骼肌组织氧分压的时效变化曲线与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组自建模后（夹闭血管）5 min起，PtO2均显著下降，且两组间差异无统计学意义（t=1.322，P=0.296）；与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组再灌注后5 min PtO2均显著上升，但仍低于对照组（F=8.334，P=0.006），随后I/R+VSD组PtO2持续低于I/R组直至实验结束（t=2.015，P=0.046）；实验结束去除VSD敷料后，I/R+VSD组较前显著升高，接近I/R组再灌注后5 min PtO2水平（t=4.300，P=0.038）, 见图 1。
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| I/R组为缺血-再灌注损伤组，I/R+VSD组为缺血-再灌注损伤+负压封闭引流组 图 1 骨骼肌组织氧分压的时效变化曲线 Figure 1 Timing-dependent curve of oxygen partial pressure in skeletal muscle |
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与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组HIF-1α mRNA在建模后2 h和4 h时均显著升高（F=10.120，P=0.002和F=36.480，P < 0.01）；I/R组和I/R+VSD组HIF-1α mRNA在再灌注后3 h和6 h时虽有所下降，但仍显著高于对照组（F=6.960，P=0.015和F=4.470，P=0.035）；I/R+VSD组HIF-1α mRNA在再灌注后3 h和6 h时均高于I/R组（t=1.799，P=0.048和t=5.911，P=0.019），见表 2。
| 组别 | 建模后2 h | 再灌注前（建模后4 h） | 再灌注后3 h | 再灌注后6 h |
| 对照组 | 1.012±0.008 | 1.027±0.011 | 1.019±0.021 | 1.040±0.033 |
| I/R组 | 5.780±0.544b | 8.438±1.593b | 2.516±0.733a | 1.324±0.429a |
| I/R+VSD组 | 5.941±0.609b | 8.198±1.506b | 3.858±1.057ac | 3.299±0.872bc |
| F值 | 10.120 | 36.480 | 6.960 | 4.470 |
| P值 | 0.002 | < 0.01 | 0.015 | 0.035 |
| 注：I/R组为缺血-再灌注损伤组，I/R+VSD组为缺血-再灌注损伤+负压封闭引流组；与对照组比较，aP < 0.05，bP < 0.01；与I/R组比较，cP < 0.05 | ||||
与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组HIF-1α蛋白表达相对灰度比在再灌注前、再灌注后3 h和6 h分别为16.780±4.352和15.198±3.773、2.516±0.341和3.858±0.537、1.324±0.264和3.299±0.413；其中，I/R组HIF-1α蛋白表达在再灌注前和再灌注后3 h均显著升高（t=15.567，P < 0.01和t=2.768，P=0.031）；I/R+VSD组HIF-1α蛋白表达在再灌注前、再灌注后3 h和6 h均显著升高（t=13.438，P < 0.01；t=7.854，P=0.009；t=6.442 P=0.011）；且I/R+VSD组HIF-1α蛋白表达在再灌注后3 h和6 h均高于I/R组（t=1.878，P=0.046；t=2.609，P=0.030），见图 2。
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| I/R组为缺血-再灌注损伤组，I/R+VSD组为缺血-再灌注损伤+负压封闭引流组；与对照组比较，aP < 0.05，bP < 0.01；与I/R组比较，cP < 0.05 图 2 骨骼肌组织中HIF-1α蛋白表达的时效变化 Figure 2 Timing-dependent changes of HIF-1α protein in skeletal muscle |
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如表 3所示，与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组再灌注后6 h外周静脉血中LA表达显著升高（F=9.540，P=0.002）；其中，I/R+VSD组显著低于I/R组（t=2.263，P=0.040）。与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组实验结束后（处死后）骨骼肌中LA表达显著升高（F=13.750，P < 0.01）；其中，I/R+VSD组显著低于I/R组（t=3.617，P=0.027）。
| 组别 | 外周静脉血（mmol/L） | 骨骼肌组织（mmol/L） | |||
| 建模前 | 建模后4 h（再灌注前） | 再灌注后6 h（处死前） | 处死后 | ||
| 对照组 | 1.373±0.147 | 1.415±0.172 | 1.400±0.151 | 2.216±0.336 | |
| I/R组 | 1.405±0.163 | 1.420±0.201 | 3.341±0.379a | 6.732±1.631a | |
| I/R+VSD组 | 1.388±0.161 | 1.408±0.196 | 3.017±0.538ab | 4.599±1.043ab | |
| F值 | 1.440 | 1.280 | 9.540 | 13.750 | |
| P值 | 0.375 | 0.462 | 0.002 | < 0.01 | |
| 注：I/R组为缺血-再灌注损伤组，I/R+VSD组为缺血-再灌注损伤+负压封闭引流组；与对照组比较，aP < 0.01；与I/R组比较，bP < 0.05 | |||||
临床上，休克、挤压伤和捆扎止血都可以造成全身和局部区域的缺血缺氧改变，其中骨骼肌是最易受累的组织之一。骨骼肌的直接损伤和缺血可引起细胞变性和坏死，继发肌红蛋白尿损伤肾脏，而再灌注后的氧化应激反应，使得组织内氧自由基释放、细胞内钙超载和线粒体损伤，可导致损伤的进一步加重[11]。同时，由于缺血前预处理不适用创伤患者，所以采用何种有效的后预处理方式来减轻再灌注损伤成为了临床研究的重点之一。
HIF-1α是一类对氧极其敏感的核转录因子，在常氧环境极易降解失活，无法发挥其调节效应[12]；而在低氧条件（O2% < 5%）下主要发挥低氧耐受效应，调控下游糖酵解途径酶、细胞生成素、血红素氧合酶-1、诱导型一氧化氮合酶等多种促细胞生存基因的转录激活，提高低氧状态下的细胞生存率，但是在无氧条件（O2% < 0.1%）下时却发挥细胞程序性死亡效应，诱导严重缺氧细胞发生凋亡和自噬[13-14]，以减轻线粒体损伤、细胞坏死引起的胞内物质释放和失控性炎症反应的发生[15]。因此，HIF-1α同组织氧分压密切相关，可以直接反映缺氧程度。而LA是无氧代谢糖酵解中丙酮酸的重要代谢产物，可以间接反映局部缺氧程度。
VSD技术是我科白祥军教授积极推广的一项创新性的物理创面治疗技术[16]，可明显预防和改善创面感染，加快创面愈合，2008年遴选进入国家卫生部“十年百项”计划以来，已予以全国推广并广泛应用于各种急慢性创面的治疗中[17]。同时，国内外的临床研究均表明，应用VSD技术可有效改善缺血和再灌注所造成的损害[8, 18]，但其具体作用机制尚不明确。
推测在缺血-再灌注损伤中，VSD技术可区域性调节PtO2，进而对缺氧状态下一系列分子、细胞、组织、系统进行干预。本研究结果证实：（1）对照组未阻断血管，PtO2稳定，而I/R组和I/R+VSD组建模后PtO2持续下降接近无氧状态，再灌注后，即使恢复血运，但仍低于对照组，而且I/R+VSD组显著低于I/R组，实验结束去除VSD敷料后，I/R+VSD组PtO2较前显著升高，则提示该技术可以降低局部PtO2；（2）与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组HIF-1α mRNA在建模后均显著升高，可能同血管阻断后，PtO2持续下降引起了HIF-1α mRNA的上调有关；恢复灌注后HIF-1α mRNA则表达下调，低于再灌注前水平，说明一旦从无氧状态转变为低氧状态，氧感受器信号再次发生变化，HIF-1α所发挥的功能就可能由促凋亡和自噬转变为低氧耐受，反馈调节HIF-1α mRNA的表达。而I/R+VSD组在再灌注后HIF-1α mRNA高于I/R组，提示VSD技术进一步降低了PtO2；（3）与对照组比较，I/R组再灌注前和再灌注后3 h HIF-1α蛋白表达显著升高，I/R+VSD组在再灌注前、再灌注后3 h和6 h HIF-1α蛋白表达均显著升高，提示无氧状态下HIF-1α蛋白因避免被降解失活而积聚，可持续发挥核转录作用；而与I/R组比较，I/R+VSD组在再灌注后的表达显著升高，提示即使恢复血运后，VSD技术仍然可以通过降低局部PtO2来减少HIF-1α蛋白的降解；（4）与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组再灌注后6 h外周静脉血中LA较高，提示缺血-再灌注后，损伤组织以无氧代谢为主，通过糖酵解的途径满足缺氧状态下细胞的能量需求。但是，I/R+VSD组LA却显著低于I/R组，可能同负压吸引在再灌注早期就直接加快组织微循环相关，可避免“无复流现象”，以提供更多的能量代谢底物；亦或同其调节HIF-1α蛋白和其下游关键酶的表达，间接减轻氧化应激对细胞、线粒体的损伤，提高有氧代谢率相关。与对照组比较，I/R组和I/R+VSD组实验结束后骨骼肌中LA表达显著升高，而且I/R+VSD组显著低于I/R组，提示VSD技术虽然降低了局部PtO2，但是可能通过促进微循环等方式改善了组织的无氧代谢，这同VSD技术构成敷料中心局部区域低氧和外周循环高灌注的“黑洞效应”并无矛盾[10]。
综上所述，本研究表明，VSD技术通过降低局部PtO2，不仅可以上调HIF-1α mRNA的表达，而且显著减少HIF-1α蛋白的降解，使HIF-1α蛋白短时间积聚和合成增加，同时通过改善组织无氧代谢，减轻乳酸堆积。其作用机制可能是负压调节微循环氧供的平衡，减轻了氧反常的有害作用[19]；以及局部缺氧状态通过HIF-1α途径，起到对细胞低氧耐受的保护作用来实现的。但是如同高压氧治疗一样[20]，如何通过VSD技术来调节负压和局部PtO2的变化，避免氧反常的同时达到组织微循环的高灌注，彻底熟悉VSD技术“黑洞效应”的变化特点，使HIF-1α途径在无氧和低氧状态中达到平衡（既减少细胞的坏死和凋亡，又增加细胞的低氧耐受，最终提高细胞存活率），还需要进一步的实验来探索。
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