脓毒症肺损伤在危重症患者中有着很高的发病率和病死率,主要特征表现为炎性细胞活化和弥漫性肺泡损伤[1-2]。革兰阴性细菌外膜释放的脂多糖(LPS)被认为是引起脓毒症肺损伤的重要因素[3]。当机体受到LPS刺激时,可导致肺泡上皮细胞、肺毛细血管内皮细胞和肺间质的急性弥漫性损害,巨噬细胞在肺内聚集、浸润、活化,释放大量炎症介质和细胞因子,引起急性肺损伤甚至急性呼吸窘迫综合征[4]。
外泌体是细胞分泌的一种囊泡状小体,直径为30~100 nm,其携带了脂质、蛋白质、核酸等多种生物活性成分,可通过直接接触或膜融合的方式将囊内的活性成分转移至靶细胞,从而参与各种生理病理过程[5-6]。已有研究表明在受到细菌刺激时,来源于肺泡巨噬细胞的外泌体通过传递促炎因子il-36γ可诱发肺损伤[7]。但在脓毒症肺损伤中,来源于肺泡上皮细胞的外泌体所发挥的作用尚不清楚。本研究旨在探讨在脓毒症肺损伤中, 肺泡上皮细胞分泌的外泌体是否对肺泡巨噬细胞产生致炎作用,为进一步了解脓毒症肺损伤的发生发展机制开辟新思路。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383、大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞株RLE-6TN均购自上海中国科学院细胞库; 胎牛血清(Gibco公司,美国); 青霉素、链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司,中国); DMEM /F-12、Ham F-12K培养液、GW4869、PKH-26荧光染料、CSFE荧光染料、DAPI染料和LPS(E.coli,O111:B4)(Sigma公司,美国); 兔抗大鼠CD9单克隆抗体(Abcam公司,英国); 兔抗大鼠CD63单克隆抗体(Santa Cruz公司,美国); 辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司,中国); 逆转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司,日本); TRIzol试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒和SuperSignal West Femto化学发光底物(Thermo Fisher公司,美国); 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-1β、IL-6)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司,中国); Transwell培养板(0.4 μm孔径,Corning公司,美国); 微量蛋白核酸定量分析仪、ABI Step One Plus实时荧光定量PCR仪和超速离心机(Thermo Fisher公司,美国); H-7650透射电子显微镜(Hitachi公司,日本); 高分辨率可调电阻脉冲生物颗粒检测仪(Izon公司,美国); FV3000激光共聚焦显微镜(Olympus公司,日本); 凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司,美国)
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养肺泡巨噬细胞株NR8383培养于含15%胎牛血清、1.5 g/L碳酸氢钠的Ham F-12K完全培养基中,37℃、5%CO2培养箱内培养,2~3 d更换1次培养基,当细胞生长融合至80%时传代1次。肺泡Ⅱ型上皮细胞株RLE-6TN培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,于37℃、5% CO2培养箱内培养,每2~3 d传代1次,传代时用含质量分数为0.25%的胰蛋白酶-EDTA细胞消化液消化。
1.2.2 Transwell共培养及实验分组分别取对数生长期的NR8383和RLE-6TN,利用Transwell小室和6孔板构建共培养体系:将RLE-6TN随机分为4组,各组处理如下:正常组:正常的RLE-6TN; LPS组:RLE-6TN经过LPS(终浓度为1μg/mL)刺激24 h; GW4869组:RLE-6TN经过外泌体抑制剂(GW4869,终浓度为10 μmol)预处理8h;GW4869+LPS组:RLE-6TN先经过外泌体抑制剂(GW4869,终浓度为10 μmol)预处理8 h,再加入LPS(终浓度为1μg/mL)刺激24 h。RLE-6TN细胞经过各组处理后以5×105/孔接种于Transwell小室中(即上室),NR8383细胞以1×106/孔接种于6孔板中(即下室),待细胞贴壁后将Transwell小室插入6孔板中共培养。NR8383单培养作为空白对照组。12 h后收集各组NR8383细胞,进行后续实验。
1.2.3 外泌体的提取RLE-6TN用完全培养基(DMEM/F-12+10%的FBS+双抗)培养,当细胞增殖达到80%时,用PBS冲洗细胞表面,换DMEM/F-12基础培养基培养并加入LPS(终浓度为1 μg/mL),在37℃,5%CO2培养箱中静置培养24 h。收集细胞上清液,4℃ 300×g离心10 min,取上清液弃残余细胞,2 000×g离心10 min除去细胞碎片,取上清液经10 000×g离心30 min,进一步出去细胞碎片,取上述上清液,用0.22 μm的过滤器处理进行过滤,除去外泌体以外的微泡,4℃,100 000×g超高速离心70 min,去除上清液而留下的沉渣及外泌体,用PBS溶液重悬外泌体,再次4℃,100 000×g超高速离心70 min,即获得纯度较高的实验组外泌体(实验组Exo),自未加LPS刺激的RLE-6TN细胞提取的外泌体悬液作为对照组外泌体(对照组Exo),将外泌体转移至1.5 mL的EP管中,-80℃保存备用。
1.2.4 外泌体形态的观察取20 μL外泌体悬液,滴于孔径为2 nm的载样铜网上,室温静置2 min,用滤纸从滤网侧边吸去多余的液体,滴加3%磷钨酸溶液30 μL,室温负染5 min,用滤纸吸干负染液,晾干,将铜网置于透射电镜的样品室内,观察外泌体形态并拍摄透射电镜照片。
1.2.5 外泌体直径的检测使用Izon颗粒分析仪检测外泌体的直径。用标准品标准化设备后,将样品用PBS缓冲液稀释100倍,混匀,按操作要求将100μL稀释液注入加样板中,随后检测样品颗粒的直径。
1.2.6 蛋白印迹法(Western Blot)检测外泌体表面蛋白标记采用RIPA裂解液提取外泌体内的蛋白质,通过BCA法测定外泌体蛋白的浓度。制胶(12%分离胶,5%浓缩胶),取外泌体蛋白40μg经电泳分离后转移至硝酸纤维素膜,封闭后分别加稀释后兔抗CD9(1 : 1 000稀释)、CD63(1 : 1 000稀释)单克隆抗体,4℃过夜孵育,TBST洗膜3次,分别滴加HRP标记的二抗(1:4 000稀释),室温孵育2 h,TBST洗膜,化学发光底物检测杂交信号,凝胶成像系统下观察条带显影并拍照。
1.2.7 外泌体的标记和摄取按照PKH-26红色荧光标记试剂盒说明书步骤,对外泌体进行标记。将荧光染料PKH-26(400μL)加入到外泌体悬液中,室温孵育5 min后用等体积的无外泌体血清进行封闭,用PBS洗涤2次,去除未结合的染料。将PKH-26标记的外泌体与NR8383细胞(1×105个)共培养5 h,并用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺基氨基酯)和DAPI标记细胞,于共聚焦显微镜下观察拍照。
1.2.8 外泌体与NR8383细胞共培养及实验分组选取生长状态良好的NR8383细胞,随机分为PBS组、对照组和实验组,以1×106/孔的密度接种于6孔板,分别加入实验组外泌体和对照组外泌体(终浓度都为10μg/mL),空白组加入等体积的PBS,各组以去除外泌体血清NR8383细胞,12 h后收集各组细胞上清液,进行后续实验。
1.2.9 炎症因子表达的检测(1) qPCR技术检测mRNA表达水平细胞总RNA提取按照TRIzol试剂盒操作说明书操作,将细胞总RNA逆转录获得cDNA。应用SYBR Green荧光染料试剂盒进行qPCR。通过Ct值进行数据分析,目的基因的相对表达量以2-△△Ct表示,引物序列见表 1。
名称 | 引物序列 |
IL-6 | Forward:5'-GCTCTGGTCTTCTGGAGTTCC-3' Reverse:5'-GAGTTGGATGGTCTTGGTCCT-3' |
IL-1β | Forward: 5'-ACAAGGAGAGACAAGCAACGA-3' Reverse:5'-TCTGCTTGAGAGGTGCTGATG-3' |
TNF-α | Forward: 5'-GGCAGCCTTGTCCCTTGAAGAG-3' Reverse:5'-GTAGCCCACGTCGTAGCAAACC-3' |
β-actin | Forward: 5'-TACTGCCCTGGCTCCTAGCA-3' Reverse:5'-TGGACAGTGAGGCCAGGATAG-3' |
(2) ELISA技术检测细胞上清液细胞因子的水平按照ELISA说明书步骤,检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平。
1.3 统计学方法所有数据均使用SPSS 20.0软件进行数据分析,应用GraphPad Prism 5软件作图。数据以均数±标准差(x±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析,进一步组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Transwell共培养条件下RLE-6TN细胞对NR8383细胞炎症因子mRNA水平的影响经过不同处理的RLE-6TN细胞与NR8383共培养12 h后,利用qPCR检测NR8383细胞中炎症因子的mRNA表达水平,结果显示:与空白对照组相比,脂多糖刺激的RLE-6TN引起NR8383细胞IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平显著升高(P < 0.01),差异有统计学意义,而GW4869组的IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平却无明显变化(P > 0.05),差异无统计学意义; GW4869+LPS组与LPS组相比,IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平都显著降低(P < 0.01),这说明外泌体抑制剂(GW4869)能够削弱经LPS刺激的RLE-6TN细胞对NR8383细胞炎症因子表达的影响,同时值得注意的是,正常的RLE-6TN对NR8383细胞炎症因子的mRNA水平无影响。由此表明,LPS刺激RLE-6TN细胞分泌的外泌体能够对NR8383细胞炎症因子的表达水平产生影响,见图 1。
2.2 外泌体的收集与鉴定透射电镜下,实验组外泌体(实验组Exo)为圆形或椭圆形的膜性小囊泡,直径为40~100 nm,可见特征性杯状囊泡。蛋白免疫印迹实验结果显示实验组和对照组外泌体均表达膜蛋白分子(CD 63、CD 9),两者的相对相对分子质量分别为43 kd、25 kd。高分辨率可调电阻脉冲检测样品颗粒直径,TRPS结果显示:粒子直径的众数为107 nm,平均直径为126 nm,见图 2。
2.3 NR8383细胞吞噬外泌体用PKH-26红色荧光标记的实验组和对照组外泌体分别与NR8383细胞共培养5 h后,用CFSE绿色荧光染料标记NR8383细胞的胞质,用DAPI染料标记NR8383细胞的胞核,于共聚焦显微镜下观察,结果显示:两组NR8383细胞形态皆正常,胞质内散在的红色荧光颗粒即为染色后的被NR8383细胞吞噬的外泌体,见图 3。
2.4 外泌体对NR8383细胞炎症因子表达的影响将实验组、对照组外泌体(终浓度都为10μg/mL)与等体积的PBS分别加入NR8383细胞中,12 h后用ELISA法测定细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量,结果显示:实验组IL-6、TNF-α、IL-1β的蛋白含量均显著高于PBS组,差异有统计学意义(P < 0.01),而对照组与PBS组差异无统计学意义(P > 0.05)见表 2。
组别 | IL-1β | TNF-α | IL-6 |
PBS组 | 36.17±12.11 | 34.83±5.01 | 42.45±11.01 |
对照组Exo | 46.11±5.29 | 40.07±6.10 | 54.55±8.05 |
实验组Exo | 251.81±38.11a | 385.51±30.44a | 306.10±51.61a |
注:IL-1β,白细胞介素-1β; TNF-α,肿瘤坏死因子-α; IL-6:白介素-6;空白组在NR8383细胞中加入与实验组Exo等体积的PBS; 对照组Exo正常的RLE-6TN细胞分泌的外泌体; 实验组Exo:LPS刺激RLE-6TN细胞24 h分泌的外泌体; 与PBS组相比,aP < 0.01 |
外泌体是由双层脂质膜构成的微泡颗粒,可由不同类型的细胞脱落释放,存在于多种体液中[8]。外泌体通过传递特定的信息(如:miRNA、DNA、蛋白质等)到受体细胞,介导细胞通讯及信息传递,在各种病理生理学进展中发挥重要作用[9]。本研究利用差速超速离心法成功提取肺泡上皮细胞分泌的外泌体,经透射电镜观察、Western Blot检测和粒子直径检测结果均符合外泌体的特征。
长期以来,一直有研究证实,外泌体介导了应激条件下肺泡上皮细胞与免疫细胞之间的联系,Lee等发现酸诱导肺泡上皮产生的微囊泡可以介导巨噬细胞的迁移,以及在高氧条件下,肺上皮细胞衍生的细胞微囊泡可通过microRNA激活巨噬细胞介导炎症反应[10-11]。另外,Moon等发现高氧诱导肺泡上皮细胞衍生的外泌体,可以通过传递促凋亡因子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)而激活巨噬细胞,从而导致肺部炎症反应[12]。但是在脓毒症肺损伤中,肺泡上皮产生的外泌体对肺泡巨噬细胞的影响尚未见报道。
本研究利用LPS刺激肺泡上皮细胞建立脓毒症肺损伤模型,在Transwell共培养体系中,我们发现,经LPS刺激的肺泡上皮细胞能够使肺泡巨噬细胞炎症因子的mRNA水平显著提高,然而当对LPS刺激的肺泡上皮细胞用外泌体抑制剂(GW4869)进行预处理8 h后,这种致炎作用却遭到明显削弱。当把提取的外泌体与肺泡巨噬细胞共培养后发现,LPS刺激肺泡上皮产生的外泌体能够激活肺泡巨噬细胞释放大量炎性因子,而正常的肺泡上皮细胞分泌的外泌体对肺泡巨噬细胞炎症因子的表达却无任何影响。众所周知,外泌体的功能受生理和病理的影响,会随着细胞外环境的改变而发生动态的变化[13-15]。因此,笔者推测,LPS的刺激会导致肺泡上皮细胞分泌的外泌体内的成分发生改变,当这些外泌体被肺泡巨噬细胞摄取之后,改变了肺泡巨噬细胞的信号通路,激活肺泡巨噬细胞产生炎症反应,这需要后续的实验进一步证实。
综上所述,可以初步判断,在脓毒症肺损伤中,肺泡上皮细胞分泌的外泌体能够激活肺泡巨噬细胞产生致炎作用。这种由外泌体介导的细胞间信息交流方式可能在脓毒症肺损伤的发病机制中发挥重要作用,这将为临床治疗和诊断提供新的靶点。然而在脓毒症肺损伤中,肺泡上皮细胞分泌的外泌体是介导何种分子来发挥作用,又是以何种方式扮演关键角色,至今仍不清楚,这些将是后续研究有待解决的科学问题。
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