齐墩果酸(oleanolic acid)又名庆四素,为五环三萜类化合物,广泛存在于各种草本植物中,据不完全统计,约有126种草本植物中含有齐墩果酸,如:丁香、川西獐牙菜、女贞子、牛膝、西洋参、人参、连翘、景天三七、甘草、关木通、东北龙胆、枇杷叶、苏和香、小茴香、雪胆、夏枯草等[1-2]。其在不同植物中以不同形式存在,在雪胆等植物的根和根茎中主要以皂苷形式存在,而在川西獐牙菜、女贞子等植物的叶和果中则主要以游离形式存在[3-4]。OA的药理作用不断被发现且逐渐深入,因而引起了广泛关注。现研究表明[5-7],OA具有保护肝肾功能、双向免疫调节、抑制血小板凝集、降血脂、降血糖、抗病毒、消炎、抗突变及抗癌等药理作用。齐墩果酸胶囊是临床常用的急慢性肝炎辅助治疗药物,可通过降低血清中丙氨酸氨基转移酶的水平而促进肝细胞再生,加速坏死组织修复。胆汁淤积是常见的临床综合征,目前对其治疗缺乏有效的药物,为了进一步开发治疗急性胆汁淤积肝损伤的药物,本研究对临床常用药物齐墩果酸胶囊进行了研究,以明确其是否在胆汁淤积时发挥护肝作用。胆汁淤积的相关研究表明:胆汁淤积的发生发展与肝细胞表面胆酸转运蛋白的异常表达相关[8]。因此,本研究构建了胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型(bile duct ligated,BDL)并使用OA进行干预,对胆酸排泌泵和核受体进行研究,旨在为临床治疗胆汁淤积提供线索。
1 材料与方法 1.1 主要材料与仪器SD大鼠,雄性,6~7周龄,体质量200~220 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。齐墩果酸胶囊购自陕西奥星制药有限公司,实验时用灭菌生理盐水溶解。RIPA Lysis Buffer购自Sigma公司; 蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自Roche公司; BCA蛋白定量试剂盒、Supersingnal West Femto maximum sensitivity substrate Kit购自Pierce Biotechnology公司; Mrp4、Oatp1、AhR、Nrf2、GAPDH一抗购于Santa Cruz公司,山羊抗兔或鼠IgG- HRP二抗购自Pierce Biotechnology公司; Trizol试剂购于Invitrogen公司,逆转录试剂盒购自TaKaRa公司(Code No.RR047A),PCR试剂盒购自TaKaRa (Code No.RR820A); Mrp4、Oatp1、AhR、Nrf2、GAPDH由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; 荧光定量PCR仪购自Bio- Rad公司。
1.2 方法 1.2.1 大鼠模型的建立及处理BDL模型的建立:大鼠称重后,每100 g体质量给予1.5 mL 0.3%戊巴比妥钠进行麻醉。75%酒精消毒后,备皮,将大鼠转移至灭菌的大鼠固定板上,四肢固定后再次消毒腹部皮肤。沿腹正中线在剑突下1 cm处开腹,切口大小约0.5 cm,延胃寻找十二指肠,并找到肝胰壶腹,暴露胆总管,用4-0手术线分别在近端和远端结扎胆总管并进行离断,关腹。
大鼠模型的分组及处理:雄性SD大鼠200~220 g(6~7周龄)购买后在实验使用之前正常饲养1周以适应实验环境。随机数字表法将其分为3组(每组10只):假手术组(sham组):只做开腹手术并使用0.9%生理盐水灌胃7 d,每天1次; 胆道结扎组(BDL组,bile duct ligated组):做胆道结扎手术并使用0.9%生理盐水灌胃7 d,每天1次; 胆道结扎并灌胃齐墩果酸组(BDL+OA组,bile duct ligated+oleanolic acid组):做胆道结扎手术并使用100 mg /kg齐墩果酸灌胃7 d,每天1次,连续处理7 d后,处死大鼠,取其肝脏、肾脏、肠道、血液、尿液、胆汁等,保存于-80℃,备用。
1.2.2 PCR反应按Trizol试剂说明书提取大鼠肝脏的总RNA取1 μg总RNA按PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real- time)说明书逆转录生成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行PCR操作。PCR反应条件:25μL体系,上下游引物各1 μL,大鼠引物序列如表 1。
1.2.3 蛋白免疫印迹反应参照文献[9]报道的方法提取大鼠肝脏蛋白,BCA法进行蛋白定量,进行5%的浓缩胶和10%的分离胶SDS-PAGE电泳,每孔上样量为80 μg总蛋白。浓缩胶60 V电泳1 h左右,待Marker完全分开,清晰可见后,转为100 V电泳2 h,待溴酚蓝完全泳出凝胶后停止电泳。常规湿法转膜80 min,含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h,加一抗(Mrp4 1:1 000,Oatp1 1:1 000,Nrf2 1:2500, AhR 1:2 500,GAPDH 1:50 000),4 ℃孵育过夜,用TBST洗去一抗后加入相应的二抗(1:50 000),室温孵育1 h,ECL化学发光,凝胶成像系统显影。
1.2.4 免疫荧光反应将新鲜肝组织用OCT包埋后制作成6~8 μm冰冻切片,冰丙酮固定30 min,PBS漂洗3次,0.4% Triton X-100 /0.01 mol/L PBS浸泡30 min,PBS漂洗3次,加山羊血清封闭30 min,再次使用PBS漂洗后,加入Mrp4 1:150抗体染片,4 ℃过夜后加入FITC标记的相对应的荧光二抗,37 ℃孵育60 min,中性树胶封片后镜检。
1.3 统计学方法应用SPSS17.0进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,以P < 0.05具有统计学意义。
2 结果 2.1 齐墩果酸上调胆道结扎大鼠胆汁淤积模型肝脏组织Mrp4的表达,而对Oatp1无影响齐墩果酸连续7 d灌胃胆道结扎的大鼠,收取肝脏组织,提取RNA和总蛋白后,分别在mRNA和蛋白水平研究齐墩果酸对肝脏胆酸排泌泵的影响,结果发现:与sham组相比较,BDL组和BDL+OA组大鼠肝脏组织Mrp4表达增高,其中BDL组在mRNA水平表达增高1.8倍,在蛋白水平表达增高1.3倍; BDL+OA组在mRNA水平表达增高2.3倍,在蛋白水平表达增高1.8倍,差异有统计学意义; 而Oatp1在BDL组和BDL+OA组表达虽较sham组上调,但差异无统计学意义(图 1、图 2)。肝脏组织经石蜡包埋后进行免疫荧光实验,结果显示:胆道结扎7 d后,Mrp4在BDL组和BDL+OA组的表达较sham组增高(图 3),这在组织水平对分子水平的结果进行了佐证。
2.2 齐墩果酸上调胆道结扎大鼠胆汁淤积模型肝脏组织核受体AhR、Nrf2的表达
RT-qPCR结果显示:与sham组相比较,BDL组和BDL+OA组肝脏组织核受体AhR、Nrf2表达均上调,其中AhR在BDL组表达增高1.7倍,在BDL+OA组表达增高2.8倍,Nrf2在BDL组表达增高1.5倍,在BDL+OA组表达增高2.1倍,P < 0.05,差异具有统计学意义(图 4)。蛋白免疫印迹结果显示:无论在BDL组还是BDL+OA组,AhR、Nrf2表达均增高,其中在BDL组,AhR表达增高1.3倍,Nrf2表达增高1.4倍; 在BDL+OA组AhR表达增高1.9倍,Nrf2表达增高1.8倍,差异具有计学意义(图 5)。
3 讨论
胆汁淤积是常见的临床综合征,目前临床治疗胆汁淤积的有效药物只有熊去氧胆酸(UDCA),但其个体差异较大,有效性较差,因此,临床亟需开发治疗胆汁淤积的有效药物,但研发新药不仅需要大量的资金支持且周期较长,因此,从临床已使用的保肝药物中筛选有效的药物不失为一种快速便捷的方法。齐墩果酸早在上世纪80年代便应用于临床治疗急性肝损伤,其能够有效抑制CYP2A、CYP2E1、CYP3A4等的表达,从而发挥肝脏保护作用[10-12]。文献报道,川西獐牙菜纯提物能够对阻塞性胆汁淤积大鼠肝脏产生保护作用,这种保护作用可能是通过核受体Nrf2、Lrh-1、CPF、PXR调控肝细胞膜上的胆酸转运蛋白Mrp4、Mrp3、Bsep等发挥作用[13-15],并且利用HepG2细胞对胆酸转运蛋白Mrp3进行了研究,证实川西獐牙菜醇提物可显著诱导核受体CPF、PXR和核转录因子SP1 mRNA和蛋白水平高表达,且其对核受体PXR和核转录因子SP1的上调作用明显强于UDCA[16]。而其中的有效成分之一便是齐墩果酸。结合文献报道和笔者在临床对齐墩果酸胶囊的实际应用情况,对齐墩果酸是否能够对急性梗阻性胆汁淤积发挥治疗作用产生兴趣。为此,本研究构建了胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型以模拟急性梗阻性胆汁淤积,并连续7 d灌胃齐墩果酸,通过在mRNA和蛋白水平对肝细胞胆酸排泌泵Mrp4和Oatp1进行研究,齐墩果酸灌胃胆道结扎的大鼠后,其肝细胞表面Mrp4表达显著增高。
Mrp4属于多药耐药相关蛋白家族成员,为不依赖ATP的有机阴离子转运体,位于肝细胞基底膜面,主要负责将肝细胞内多余的胆汁酸分泌入血液,从而减少肝细胞内胆汁酸和其他毒性物质的积聚,发挥肝脏保护作用,其广泛分布于机体各组织器官,包括脑、肝脏、肾脏、胰腺、红细胞等细胞表面,相关研究表明:在胆汁淤积的动物模型中,Mrp4在肝脏中表达增高,但在肾脏中表达下降[17],这被认为是肝细胞对胆汁淤积的适应性自我保护作用。胆道结扎的大鼠灌胃齐墩果酸后,Mrp4的表达显著上升,说明胆汁淤积时,齐墩果酸能够促进肝细胞表面Mrp4的表达从而发挥保护肝脏的作用。
研究表明:胆汁淤积时,Mrp4的表达上调与核受体CAR密切相关[18]。核受体超家族(nuclear receptor superfamily)是一组配体激活的转录因子家族,通过在信号分子与转录应答间建立联系,调控着细胞的生长和分化。人类核受体家族包含48个成员,例如PPAR、FXR、LXR、VDR、RXR等。其与胆汁酸代谢关系密切,研究报道,胆汁淤积时,FXR能够上调干细胞基底侧膜的胆酸转运蛋白MRP3、MRP4、OSTα/β等以促进胆汁酸排出细胞[19]。而本研究发现,齐墩果酸处理胆道结扎的大鼠后,其肝细胞内AhR和Nrf2表达增高; 急性梗阻性胆汁淤积时,齐墩果酸能够促进肝细胞表面Mrp4的表达上调,而这种调控作用可能与AhR和Nrf2相关。
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