2018, Vol. 27
百草枯（paraquat，PQ，C12H14Cl2N2）为一种快速非选择性有机杂环类脱叶剂及除草剂。由于其价格低廉，广谱高效，对环境影响小等优点，已在130多个国家使用[1]。但PQ缺乏有效的解毒剂，人体意外或故意摄入导致的病死率高达70%~80%[2]，已经成为了一个严重的公共社会问题和急诊医学难题。
目前认为PQ肺内浓聚导致急性肺损伤和快速纤维化[3]，是PQ中毒死亡的主要原因。有文献表明[4-6]，在PQ导致急性肺损伤早期，氧化应激、炎症反应、细胞凋亡均参与其过程。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为一类重要的天然模式识别受体，能识别和结合病原相关分子模式，诱导炎性因子释放导致级联放大瀑布效应，引起炎症及器官功能损害[7]。Toll样受体3（Toll-like receptor-3，TLR3）作为TLRs家族中重要成员之一，能够刺激TLR诱导核转录因子（Nuclear factor-κappa B，NF-κB）的活化，启动机体的固有免疫和获得性免疫，已被众多学者关注和研究。Cassano等[8]用LPS刺激马的间充质干细胞，发现TLR3和TLR4表达均升高；罗苑苑和林新峰[9]发现，TLR3敲除后可以减轻脓毒症小鼠心肌细胞凋亡及炎性反应的影响。但对于TLR3在PQ导致的急性肺损伤中是否发生重要作用，尚无相关文献报道。
因此，本研究通过体内和体外实验，观察TLR3、NF-κB及下游炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）在PQ致急性肺损伤早期的炎症反应中的改变，进而为临床PQ中毒致急性肺损伤的干预提供理论依据和潜在治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 动物模型建立雄性C57BL/6J小鼠20只，8~9周龄，22~26 g，购于南京医科大学实验动物中心。小鼠在恒温恒湿通风的动物中心鼠笼中饲养：温度20~26 ℃，相对湿度30%~50 %，明暗交替12 h/12 h，自由进食进水，生长状况良好。本试验获得南京医科大学动物伦理批准（伦理编号:IACUC-14030122）。小鼠随机（随机数字法）分为2组：对照组，即生理盐水（normal saline, NS）组（n=10），处理组，即百草枯组（n=10）。PQ组小鼠单次经气道给予PQ（Sigma，美国）雾化溶剂0.2 mg/50 μL（雾化给药装置：MicroSprayer Aerosolizer, 美国），NS组小鼠单次经气道给予NS 50 μL，72 h后处死小鼠并收获支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和肺组织标本。
1.2 小鼠一般情况每日观察小鼠饮食、毛色、活动状态、呼吸情况、体质量下降等变化。若发现小鼠死亡，记录其死亡时间。
1.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集及细胞分类计数参照本课题组前期研究处理流程[10]：小鼠处死后，立即开胸，暴露气管及双肺，行气管切开，并夹闭左侧主支气管，用0.5 mL灌洗液（50 mL PBS+5 mmol/L EDTA）行BAL 3次。BALF经红细胞裂解液（Sigma，美国）裂解后，予以1 200 r/min，10 min离心，留取上清液做酶联接免疫吸附剂测定（ELISA），细胞沉淀予涂片吉姆萨染色，行细胞总数及分类计数。
1.4 肺组织病理学检查取小鼠左肺组织样本，用10%甲醛液固定24 h后，石蜡包埋、切片、脱蜡后常规行HE染色，并于光镜下观察。
1.5 BALF的ELISA测定按照ELISA试剂盒（R & D，美国）说明书对BALF进行操作，实验中设置空白对照孔和标准品孔，选择450 nm波长检测吸光度（570 nm校正波长），并根据标准品的吸光度值及相应的浓度值，制作标准曲线。根据标准曲线计算出待测样品的浓度值。
1.6 细胞模型建立拟Ⅱ型肺泡上皮细胞（A549）购于中国科学院细胞库，A549细胞在培养箱（37 ℃、含5%CO2）中，按2×106/mL的密度接种，培养在含10%胎牛血清（Sciencell，美国）的1640培养基（Gibco，美国），2 d换液一次，细胞长至80%时，予以1:3传代处理。A549细胞分别被不同浓度的PQ（0，25，50，100，200，400 μmol/L）孵育24 h，并且根据Western-blotting的结果，用PQ 400 μmol/L在不同时间点（0，1，3，6，12，24 h）孵育A549细胞。实验中所用细胞均为状态良好的对数生长期细胞。
1.7 细胞存活率检测(CCK8实验)对数生长期收集A549细胞，将其均匀地接种于96孔板（100 μL/孔）。将96孔板放在培养箱预培养至细胞贴壁后，用含有不同浓度的PQ的培养基（其中0 μmol/L被设为对照组）与细胞培养24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8（Dojindo，日本），96孔板继续在培养箱中孵育2 h，测得波长为450 nm的吸光度。
1.8 小鼠肺组织和A549细胞的Real-time PCR分别按照RNAiso Plus（TaKara，日本），PrimeScriptTM RTMaster Mix（TaKara，日本），SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKara，日本）试剂盒说明书，分别对小鼠肺组织和A549细胞行总RNA提取，逆转录，Real-time PCR。Real-time PCR过程中所有引物均由上海捷瑞公司设计和合成见表 1。根据溶解曲线和扩增曲线得知引物特异性和扩增效率。以GAPDH作为内参基因，用2-∆∆CT法对结果进行计算和分析。
| 种属 | 检测指标 | 上游引物序列（5'-3') | 下游引物序列（5'-3') |
| 小鼠 | TLR3 | TCCTTCTCCTATCTCCCAA | GTAAATGCTCGCTTCAAACT |
| 小鼠 | TNF-α | CTCTTCTCATTCCTGCTTGT | GTGGTTTGTGAGTGTGAGG |
| 小鼠 | IL-1β | ATTGTGGCTGTGGAGAAG | AAGATGAAGGAAAAGAAGGTG |
| 小鼠 | IL-6 | ATTTCCTCTGGTCTTCTGG | CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT |
| 小鼠 | GAPDH | AAGAAGGTGGTGAAGCAGG | GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT |
| 人 | TLR3 | GCAACAACAACATAGCCAACAT | GGAGGTGAGACAGACCCTTTAG |
| 人 | TNF-α | CGAAGTGGTGGTCTTGTTGCT | CCCGACTATCTCGACTTTGCC |
| 人 | IL-1β | GTGGTGGTCGGAGATTCGTAG | GAAATGATGGCTTATTACAGTGGC |
| 人 | IL-6 | GCTCTGGCTTGTTCCTCACTA | AATCATCACTGGTCTTTTGGAG |
| 人 | GAPDH | GGACCTGACCTGCCGTCTAG | GTAGCCCAGGATGCCCTTGA |
小鼠肺组织或A549细胞加入适量ripa（sigma，美国）裂解后，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，用BCA法测定蛋白浓度，加入1/4（v/v）的loading Buffer，100 ℃ 5 min变性蛋白。每条泳道中加入30 μg总蛋白的蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳。电泳完成后，在200 mA，120 min条件下转膜至PVDF微孔膜（Millipore，美国），用5%脱脂奶粉或3% BSA的TBST封闭液常温封闭1 h，然后加入相应的一抗封闭液稀释的抗体（TLR3，ab62566，英国；NF-κBp65，CST8242，美国；Phospho-NF-κBp65，CST 3033，美国；GAPDH，杭州贤至生物AB-P-R001，中国），4 ℃过夜孵育，用TBST洗涤膜15 min×3次。二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（Jacksonimmuno，美国）用封闭液稀释抗体，常温振荡孵育1 h，用TBST洗涤膜15 min×3次。将发光液A、B混合液均匀滴到膜上，置于Bio-rad凝胶成像系统成像，Western-blotting结果经Image J软件进行灰度扫描分析。
1.10 统计学方法所有数据收集整理后以均数±标准差（x±s）表示，SPSS 17.0软件进行统计分析。两组间比较选择成组t检验，多组计量资料比较选择one-way ANOVA（单因素方差分析）检验（q检验），以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 动物的一般情况PQ组小鼠在给药24 h后出现毛发松散、呼吸急促，活动减少等症状；给药后72 h出现进食减少，体质量明显下降（图 1），毛色不光泽，呼吸费力，活动明显减少等症状。NS组一般状况良好，未出现上述症状。
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| D0，D1，D2，D3为PQ暴露天数（d），（aP < 0.01） 图 1 小鼠体质量变化 Figure 1 Body weight change in mice |
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光镜下观察BALF涂片，行细胞总数及分类计数。发现与NS组比较，PQ组BALF细胞总数明显升高[NS:（0.018 8±0.102 1）×105 vs. PQ:（0.237 4±0.121 7）×105, t=9.804, P < 0.01]，伴有巨噬细胞[NS:（0.162 8±0.086 53）×105 vs. PQ:（1.063 3±0.343 3）×105, t=8.043, P < 0.01]，淋巴细胞[NS:（0.006 6±0.005 2）×105 vs. PQ:（0.171 2±0.099 1）×105, t=5.243, P < 0.01]和中性粒细胞[NS:（0.000 04±0.000 1）×105 vs. PQ:（0.901 9±0.652 5）×105, t=4.370, P < 0.01]明显升高（图 2）。
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| 与NS组比较，aP < 0.01 图 2 BALF中细胞计数及分类 Figure 2 Cell counting and cytospin in BALF |
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NS组小鼠肺组织标本外观呈粉红色，弹性好；病理切片（图 3A-B）见肺组织结构清晰，间质血管无扩张，无出血点，无炎性浸润，肺泡腔洁净，肺泡壁薄，支气管黏膜上皮完整。PQ组小鼠肺组织标本肿胀变大，局部充血；病理切片（图 3C-D）肺间质及肺泡腔内炎性细胞浸润，伴弥漫性肺出血、肺泡塌陷，肺间质水肿和广泛的肺泡间隔增厚。
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| A：NS组（放大100倍）；B：NS组（放大400倍）；C：PQ组（放大100倍）；D：PQ组（放大100倍） 图 3 小鼠肺组织病理切片HE染色 Figure 3 Pathological section of lung tissue with HE stain in mice |
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经ELISA试剂盒检测，与对NS组比较，PQ组支气管肺泡灌洗液的TNF-α、IL-1β、IL-6表达明显上升[TNF-α: NS:（2.782 1±3.521 5）vs. PQ:（7.512 6±3.459 8）pg/mL, t=3.030, P < 0.05；IL-1β: NS:（22.687 5±14.229 3）vs. PQ:（163.1004±81.118 3）pg/mL, t=5.391, P < 0.01；IL-6: NS:（1.653 3±0.442 7）vs. PQ:（648.5656±422.606 1）pg/mL, t=4.841, P < 0.01]（图 4）。
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| 与NS比较，aP < 0.05, bP < 0.01 图 4 ELISA法检测BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量变化 Figure 4 Change of TNF-α, IL-1β, IL-6 level in BALF by ELISA assay |
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通过CCK8实验评价PQ对A549细胞损伤。不同剂量PQ对A549细胞存活率影响差异有统计学意义（F=18.07，P < 0.01）。以0 μmol/L作为对照组，进行两两比较，结果示：A549细胞在25~100 μmol/L不同浓度PQ暴露24 h，细胞存活率无明显下降；在200 μmol/L PQ情况下，细胞存活率下降约25.3%，与对照组比较差异有统计学意义（q'=4.751，P < 0.05），在400 μmol/L PQ，细胞存活率下降约36.4%，与对照组比较差异有统计学意义（q'=6.829，P < 0.01）（图 5）。
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| 与0 μmol/L比较，aP < 0.05, bP < 0.01 图 5 CCK8检测不同浓度PQ对A549细胞存活率的影响 Figure 5 The cell viability mediated by PQ in A549 cells by CCK8 |
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小鼠肺组织中，PQ组与NS组比较，TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR3在mRNA水平表达均上升，差异均具有统计学意义（aP < 0.05，bP < 0.01）。A549细胞暴露在400 μmol/L PQ 1h，TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR3在mRNA水平表达均上升，差异有统计学意义（aP < 0.05）（图 6）。
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| A：小鼠肺组织炎性因子mRNA相对表达量；B：A549细胞在PQ 400 μmol/L暴露1 h炎性因子mRNA相对表达量，与对照组比较, aP < 0.05，bP < 0.01 图 6 TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR3在基因水平表达变化 Figure 6 mRNA expression of TNF-α, IL-1β, IL-6 and TLR3 |
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如图 7A所示，PQ组肺组织的TLR3蛋白和Phospho-NF-κBp65蛋白水平表达均明显高于NS组，差异有统计学意义（P < 0.05）。如图 7C所示，A549细胞与不同浓度的PQ（0，25，50，100，200，400 μmol/L）孵育24 h，TLR3蛋白和Phospho-NF-κBp65蛋白的表达量增加，400 μmol/L达到高峰。如图 7E所示，A549细胞的TLR3蛋白和Phospho-NF-κBp65蛋白随时间表达量而改变，1 h达到高峰。差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。
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| A-B：小鼠肺组织的Western-blotting结果及统计图；C-F：A549细胞Western-blotting结果及统计图；与对照组比较，aP < 0.05，bP < 0.01 图 7 PQ暴露对TLR3、Phospho-NF-κBp65蛋白表达的影响 Figure 7 TLR3 and Phospho-NF-κBp65 protein expression mediated by PQ |
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PQ是全世界使用最广泛的除草剂之一，但是PQ中毒的发病机制不明，且缺乏有效的解毒剂，近几年来PQ中毒事件逐年上升，而病死率却居高不下，已为世界性难题[1-2]。由于肺泡上皮细胞可主动将PQ转运到细胞内，使肺组织中PQ浓度提高10~90倍[11]。因此，急性肺损伤和快速纤维化是PQ中毒死亡的最主要原因之一[3]。目前认为PQ中毒损伤主要涉及氧自由基损伤、线粒体损伤、免疫激活及炎性介质作用等[4]。
有研究表明[12]，PQ可以诱导A549细胞炎症的发生，主要表现TNF-α、IL-1β和IL-6表达增高。Yang等[13]证实，PQ暴露可导致小鼠血清的炎性因子如TNF-α，IL-1β和IL-6和肺组织内NF-κBp65表达增高。本研究通过PQ暴露构建小鼠急性肺损伤模型，证实了小鼠肺组织病理切片有炎性细胞浸润，BALF中细胞总数明显升高，伴有中性粒细胞比例升高，炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表达也相应增高。Shen等[14]发现产生炎性因子的上游髓样分化蛋白（Myeloid differentiation primary response factor 88，MyD88）被敲除后，PQ致急性肺损伤被明显逆转。有文献研究表明在Toll样受体家族中TLR4、TLR9通过NF-κB和MyD88途径调节PQ致急性肺损伤过程[15-16]。本课题组应用Western-blotting技术发现，动物模型和细胞模型中NF-κBp65均被激活发生磷酸化改变，导致Phospho-NF-κBp65蛋白水平表达升高，从而诱导炎性因子释放。
TLRs家族是一类重要的模式识别受体，通过识别保守的病原相关分子模式启动先天性免疫应答。TLR3作为TLRs家族中的一个重要成员，主要表达于树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞中介导固有免疫应答[17]。既往认为TLR3通过识别病毒双链RNA，从而起到防御病毒感染的作用。但近期研究发现，TLR3在组织重塑、缺血-再灌注损伤、脓毒性休克等方面同样发挥着重要的作用。Royer等[18]实验证明TLR3可以促进MMP-9表达增高从而引起人类呼吸道上皮结构重塑。Zhang等[19]在肺缺血-再灌注损伤小鼠模型中发现，活化的TLR3可通过TRIF途径诱导的NF-κB的磷酸化导致调节促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表达以及细胞的增殖和凋亡，从而介导肺缺血-再灌注的炎性损伤。Doughty等[20]实验证实，TLR3配体（聚胞苷酸PIC）在早期的炎症反应中释放炎症介质，引起瀑布样级联反应，从而导致脓毒性休克的发生。Gao等[21]发现TLR3基因敲除的小鼠能明显耐受细菌性脓毒血症。既往发现[15-16]TLR4、TLR9和下游NF-κB参与PQ致急性肺损伤过程。本研究通过动物模型和细胞模型发现Phospho-NF-κBp65蛋白水平表达升高的同时上游TLR3在mRNA水平和蛋白水平表达也相应的升高。
综上所述，TLR3/NF-κB信号通路可能参与了PQ致急性肺损伤的发生发展的过程，这为深入研究其发病机制及临床治疗初步奠定了基础。
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