核转录因子-κB参与光气吸入性肺损伤NLRP3炎性小体的表达

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何岱昆, 邵义如, 周芳庆, 张琳, 申捷. 核转录因子-κB参与光气吸入性肺损伤NLRP3炎性小体的表达[J]. 中华急诊医学杂志, 2018, 27(6): 624-630. 复制到剪切板

He Daikun, Shao Yiru, Zhou Fangqing, Zhang Lin, Shen Jie. The effect of NF-κB on NLRP3 of lung tissue in rats with acute lung injury induced by phosgene[J]. Chin J Emerg Med, 2018, 27(6): 624-630. 复制到剪切板

核转录因子-κB参与光气吸入性肺损伤NLRP3炎性小体的表达

何岱昆, 邵义如, 周芳庆, 张琳, 申捷

201508 上海，复旦大学附属金山医院核化伤害应急救治中心；复旦大学化学伤害急危重病研究中心

收稿日期: 2018-01-02

基金项目: 上海市卫生和计划生育委员会科研课题（201540192）；国家自然科学基金青年基金（81101412）；国家自然科学基金（81471850）

通信作者: 申捷，Email: j1999sh@163.com.

摘要: 目的通过四氢化吡咯二硫代氨基甲酸脂（PDTC）阻断核转录因子-κB（NF-κB）信号传导通路，探讨NF-κB信号通路对光气吸入性急性肺损伤（ALI）大鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）的表达和细胞焦亡的影响。方法采用大鼠光气吸入性肺损伤动物模型。将30只大鼠随机（随机数字法）分为三组，空气对照组（吸入与光气染毒组同等流量的空气）10只，光气染毒组（吸入8.33 mg/L纯度为100%的光气5 min）10只，PDTC干预组（吸入8.33 mg/L纯度为100%的光气5 min，腹腔注射NF-κB抑制剂PDTC 100 mg/kg）10只。染毒6 h后收集血清，支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。测定中性粒细胞细胞数、蛋白含量和肺湿/干质量比(W/D)。制作肺脏石蜡切片，HE染色观察形态学改变，免疫组织化学检测肺组织中NLRP3蛋白表达水平。RT-PCR方法对肺脏组织中NF-κB p65、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）mRNA的水平进行半定量研究。蛋白质免疫印迹试验（Western blot）技术检测肺脏组织中NF-κB p65、NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白含量。采用双抗体夹心酶标免疫分析法（ELISA法）测定各组血清和BALF中IL-1β、IL-18和IL-33水平。采用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）法检测肺脏组织的细胞焦亡情况。结果成功复制光气吸入性肺损伤模型。染毒6 h后HE染色形态学观察发现：光气染毒组肺组织中大量炎性细胞浸润，免疫组织化学染色结果显示：光气染毒组肺组织中可见较多NLRP3阳性细胞。与空气对照组相比，光气染毒组肺脏组织中NF-κB p65、NLRP3和caspase-1 mRNA和蛋白表达量明显升高（P < 0.05）；与光气染毒组比较，PDTC干预组NF-κB p65、NLRP3和caspase-1 mRNA和蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。与空气对照组相比，光气染毒组血清和BALF中IL-1β、IL-18和IL-33蛋白含量明显升高（P < 0.05）；与光气染毒组比较，PDTC干预组血清和BALF中IL-1β、IL-18和IL-33蛋白含量明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。TUNEL结果提示光气染毒组肺脏组织细胞焦亡明显增多，经PDTC干预后肺脏组织细胞焦亡明显降低。结论 NF-κB信号通路促进大鼠光气吸入性ALI中NLRP3炎性小体的表达和细胞焦亡的发生，通过阻断NF-κB信号通路可下调肺脏NLRP3炎性小体的表达，抑制细胞焦亡进而减轻急性肺损伤。

关键词: 核转录因子-κB (NF-κB) 光气急性肺损伤吸入 NLRP3炎性小体细胞焦亡炎症四氢化吡咯二硫代氨基甲酸脂(PDTC)

The effect of NF-κB on NLRP3 of lung tissue in rats with acute lung injury induced by phosgene

He Daikun , Shao Yiru , Zhou Fangqing , Zhang Lin , Shen Jie

Emergency & Intensive Care Centre for Nuclear and Chemical Accident of Jinshan Hospital affiliated to Fudan University, Medical Research Centre for Chemical Injury, Emergency and Critical Care of Fudan University, Shanghai 201508, China

Corresponding author: Shen Jie, Email: j1999sh@163.com.

Abstract: Objective To observe the effect of signal transduction pathway of nuclear factor-kappa B (NF-κB) on Nod-like receptor family, pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome and pyroptosis in rats with acute lung injury induced (ALI) by phosgene. Methods The rats were randomly(random number) divided into 3 groups: air exposure control group, phosgene exposure group and PDTC group with phosgene exposure after 100 mg/kg pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) administration. The specimens of serum, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue were collected 6 h after exposure. Morphological changes were observed by HE staining. The expression of NLRP3 in the lung of three groups was detected by immunohistochemistry. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expressions of NF-κB p65, NLRP3, ASC and caspase-1 mRNA in the lung tissue. NF-κB p65, NLRP3, ASC and caspase-1 protein levels in the lung tissue were quantified by Western blot. The concentrations of IL-1β, IL-18 and IL-33 in the serum and BALF were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Pyroptosis was observed by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay (TUNEL). Results The model of phosgene-induced ALI was successfully established in rats. Morphological changes with inflammatory cell infiltration were observed in the lung tissues of phosgene group, in which NLRP3 positive cells also could be observed by immunohistochemical staining. The mRNA expressions and protein levels of NF-κB p65, NLRP3 and caspase-1 in lung tissues were significantly increased (P < 0.05) in phosgene group, compared with air control group. The mRNA expressions and protein levels of NF-κB p65, NLRP3 and caspase-1 in lung tissues were significantly decreased (P < 0.05) in PDTC group, compared with phosgene group. The IL-1β, IL-18 and IL-33 protein levels in serum and BALF were significantly increased (P < 0.05) in phosgene group, compared with air control group. The IL-1β, IL-18 and IL-33 protein levels in serum and BALF were significantly decreased (P < 0.05) in PDTC group, compared with phosgene group. TUNEL results showed that pyroptosis in the lung tissue obviously increased in phosgene group, while decreased in PDTC group. Conclusions NLRP3 inflammasome and lung cell pyroptosis were induced through NF-κB signal transduction pathway in rats with acute lung injury caused by phosgene inhalation. Blockade of NF-κB can alleviate acute lung injury by down-regulating the expression of NLRP3 inflammasome to inhibit pyroptosis.

Key words: Nuclear factor-kappa B (NF-κB) Phosgene acute lung injury Pyrin domain-containing 3 (NLRP3) innammasome Inhalation pyroptosis Inflammation Pyrrolidinedithiocarbamic acid (PDTC)

光气是一种重要的化工原料，属于窒息性毒剂，毒性大。光气经呼吸道吸入后可出现一系列以急性肺损伤（ALI）为主的临床表现，严重者可进展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）甚至死亡。近年来有关光气吸入性ALI的机制研究主要集中在炎症反应，研究已证实NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体介导的炎性反应参与了ALI的发病发展过程。NLRP3炎症小体由NLRP3、衔接蛋白-凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)和效应蛋白-天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase-1)等组成。同时，近期研究显示NLRP3炎症小体激活可生成具有活性的caspase-1，而caspase-1不仅能促进IL-1β的成熟，还可以直接诱导细胞出现程序性细胞死亡，这种以依赖caspase-1并伴有大量促炎症因子释放为特征的细胞程序性死亡方式——近年来将其称之为细胞焦亡(pyroptosis)^[1]，于2001年由Cookson等首次提出^[2]，其形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)等细胞死亡方式。研究表明在炎症反应中观察到核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）^[3-5]参与了NLRP3转录前后水平的调控，参与调控多种细胞焦亡和增殖的相关基因表达。

本实验拟复制光气吸入性急性肺损伤模型，进一步证实NLRP3炎性小体在光气吸入性急性肺损伤炎性反应中的重要作用。利用脱氧核糖核苗酸末端转移酶介导的黏性末端标记法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)检测肺脏组织的细胞焦亡情况，初步探讨依赖caspase-1并伴有大量促炎症因子释放导致的细胞焦亡在大鼠光气吸入性ALI发病机制中的作用。近年来，许多体内外实验均证实四氢化吡咯二硫代氨基甲酸脂（pyrrolidinedithiocarbamic acid，PDTC）是一种氧化还原剂，具有清除氧自由基、能够选择性地抑制NF-κB活化。本实验给予NF-κB抑制剂PDTC处理后，观察NF-κB、NLRP3炎性小体、炎症因子及细胞焦亡的变化，探讨NF-κB对光气吸入性ALI肺脏组织NLRP3炎性小体和细胞焦亡的影响。此研究将为光气吸入性急性肺损伤的诊治提供新的理论和实验基础。

1 材料与方法 1.1 实验动物

4~6周龄清洁级健康雄性SD大鼠20只, 体质量（200±20）g（上海市公共卫生临床中心），实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2010-0024。在标准动物饲养间内，给予无菌水和食物饲养。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.2 主要仪器及试剂

动态染毒柜(上海第二军医大学)，酶标仪(DENLEY DRAGON Wellscan MK-3, 芬兰Thermo公司)，洗衣板（Wellwash 4 Mk2, 芬兰Thermo公司），数字显示隔水式电热恒培养箱（PYX-DHS，上海跃进医疗器械厂），离心机（TGL-168，上海安亭科学仪器厂），移液枪（Thermo labsystems）, 台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），水浴振荡器（丹麦Heto公司）。固体三光气（海宁中联化学有限公司），N, N－二甲基甲酰胺（DMF，上海生工生物工程有限公司），环己烷（上海生工生物工程有限公司），牛血清白蛋白（美国Sigma公司），免疫组织化学试剂盒和DAB显色剂（丹麦DAKO公司），石蜡切片TUNEL实验：TUNEL试剂盒（美国Roche公司）IL-1β、IL-18和IL-33 ELISA试剂盒(美国R & D公司)，RT-PCR反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒（美国Invitrogen公司），NF-κB P65 antibody 1:1 000（美国Abcam公司），NLRP3抗体1:1 000（美国Abcam公司），ASC抗体1:100（美国Santa cruz公司），Caspase-1抗体1:1 000（美国Abcam公司），内参GAPDH(美国Santa cruz公司)。

1.3 动物分组及处理

2 g固体三光气溶于5 mL环己烷中配成质量浓度为40%三光气，置于染毒柜中，20 mL N-二甲基甲酰胺（DMF）滴定使之产生光气。将SD大鼠随机（随机数字法）分为空气对照组、光气染毒组，每组10只大鼠。空气对照组：吸入与光气染毒组同等流量的空气，未注射任何药物。光气染毒组：吸入8.33 mg/L的光气（纯度为100%）。PDTC干预组：与光气染毒组同样的处理方式，染毒后立即尾静脉注入PDTC 100 mg/kg^[6]。实验大鼠均置于染毒柜内，动态染毒5 min。

空气或光气暴露后6 h，予20%乌拉坦(1.2 mg/kg)腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血处死动物，收集全血，静置2 h后4℃离心，转速为1 500 r/min，时间为10 min。收集血清，冻存于-70℃冰箱中。每组大鼠都结扎左肺，经右支气管穿刺插管，用37℃生理盐水行右侧肺灌洗，每次2 mL，反复3次，收集约4 mL的支气管肺泡灌洗液。左侧肺组织投入液氮快速冷冻后-70℃贮存，以备下一步肺组织相关检查。

1.4 肺组织病理常规HE染色

取左肺上叶部分组织，常规制作10%多聚甲醛固定，低温石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察肺组织的病理学改变。

1.5 肺湿干比的测定

开胸取出大鼠左下肺脏，称湿质量后，置烤箱（80℃，48 h）烤至恒重，称干质量，计算肺组织湿干比值（wet/dry ratio，W/D）。

1.6 BALF中中性粒细胞数和蛋白含量的测定

每组大鼠右上肺叶都经右支气管穿刺插管，用注射器吸取冰生理盐水（4℃）5 mL，通过气管导管以较小的压力将生理盐水缓慢注入右上肺，回抽灌洗液，如此反复抽注，直至灌洗液总量达到15 mL，用血球计数板涂片细胞计数。将所得灌洗液离心（1 000 r/min，10 min）将上清液收集于15 mL离心管中，-80℃冻存，上清液进行蛋白量测定。

1.7 免疫组织化学方法检测肺组织NLRP3的表达和分布

取左肺组织石蜡切片脱蜡至水，加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min。在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，洗涤3次，每次5 min；二抗覆盖组织，室温孵育50 min，洗涤3次，每次5 min。滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。Harris苏木精复染细胞核，脱水封片，显微镜镜检，图像采集分析。石蜡切片免疫组织化学结果判读：苏木精染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。在显微镜下观察表皮细胞着色情况(×200)，按染色强度弱强。

1.8 荧光定量PCR检测肺组织中NF-κB、NLRP3、ASC和caspase-1mRNA表达量

各组大鼠中随机选取每组3例左肺组织。取组织块研磨成粉末，匀浆，离心，RNA洗涤和再溶解，总RNA纯度和浓度的测定。最后进行引物设计及PCR反应：运用Primer Premier 5结合Dnastar分析软件及网上BLAST分析，设计并合成引物，见表 1。

表 1 NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1及β-actin基因的引物序列 Table 1 The primer sequences of NF-κB P65、NLRP3、ASC、caspase-1 and GAPDH

基因名称	引物序列
NF-κB	F GGAGTACGACAACATCTCGTTGG	R GTAGAGGTGTCGTCCCATCGT
NLRP3	F CAACTCACCCAAGGAGGAAG	R TCTGAATGTTACAGCCTGGG
ASC	F GTTCAAGATGAAGCTGCTGAC	R TTCTGGCTGTGCCCTGAGCA
caspase-1	F CACATTGAAGTGCCCAAGCT	R TCCAAGTCACAAGACCAGGC
GAPDH	F CCTTCATTGACCTCAACTAC	R GGAAGGCCATGCCAGTGAGC

表选项

1.9 蛋白质免疫印迹试验（Westen Blot）检测肺组织中NF-κB、NLRP3、ASC、caspase-1的蛋白表达

左肺部分组织剪切成细小的碎片。一抗稀释比例：NF-kB P65抗体1:1 000，NLRP3抗体1:1 000，ASC抗体1:100，Caspase-1抗体1:1 000；洗膜液洗膜3次（每次5 min）。二抗：HRP山羊抗兔1:5000。洗膜液洗膜3次（每次5 min）。经过蛋白质抽提，蛋白质定量，电泳，转移，显像，免疫检测，化学发光检测等步骤完成。

1.10 血清及BALF中IL-1β、IL-18和IL-33含量的测定

采用双抗体夹心酶标免疫分析法（ELISA法）测定血清和BALF中IL-1β、IL-18和IL-33的含量。操作步骤严格按照各试剂盒说明书步骤进行。

1.11 TUNEL法检测DNA的损伤

石蜡切片脱蜡至水，修复，破膜，加试剂1, 2：按片子数量和组织大小取TUNEL试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合，阻断内源性过氧化物酶，加试剂3：切片稍甩干后，每张切片加适量试剂3(converter-POD）覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育30 min。DAB显色：切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，复染细胞核，脱水封片。

1.12 统计学方法

所有的数据均是用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较运用方差分析（LSD-t检验）。所有统计以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠的一般情况

空气对照组精神状态正常，自由活动，正常摄食、饮水。光气染毒组大鼠5 min后出现躁动不安，时而嗜睡，步态蹒跚。呼吸浅快或深快，节律不齐，时有呼吸暂停。口鼻和足爪青紫。PDTC干预组大鼠表现萎靡，活动度减少、偶尔可见饮水，呼吸急促等，但明显较光气染毒组轻。大鼠均存活，无死亡。

2.2 各组大鼠肺湿/干比值（W/D）及BALF中中性粒细胞数（Leukocytes）和蛋白含量的比较

采用W/D来反映肺组织的含水量及肺水肿的程度，光气染毒组肺W/D（7.408±0.206 7，n=10）明显高于健康对照组（4.486±0.130 3，n=10），差异有统计学意义（t=11.36，P < 0.01）；PDTC干预组（5.169±0.141 6，n=10）与光气染毒组比较，肺W/D无明显降低，差异无统计学意义（t=8.936，P > 0.05）。正常情况下，BALF中细胞数量及蛋白含量少，但光气暴露后BALF中可见大量粒细胞并伴随蛋白含量的增加，这与局部炎症反应密切相关。与健康对照组比较，光气染毒组BALF中中性粒细胞数和蛋白含量明显升高，差异有统计学意义（t=12.94，P < 0.01）。与光气染毒组比较，PDTC干预组BALF中中性粒细胞数和蛋白含量明显降低，差异有统计学意义（t=6.235，P < 0.1）。见图 1。

图 1 各组肺湿干质量比（W/D）及BALF中中性粒细胞数和蛋白含量比较 Figure 1 Comparison of wet/dry in lung, leukocytes and protein content in BALF of rats among groups

图选项

2.3 各组肺组织病理学改变

光镜下(200和400倍视野)，空气对照组可见肺泡间隔正常，肺间质无水肿，无明显炎性细胞渗出。光气染毒组可见肺泡结构紊乱，肺泡腔融合，肺泡间隔增宽，间质水肿，可见大量炎性细胞浸润。PDTC干预组可见大鼠肺泡结构较为清晰，肺泡壁稍增厚，伴少量炎性细胞浸润。见图 2。

其中光气染毒组肺组织中有大量炎性细胞浸润；PDTC干预组可见大鼠肺泡结构较为清晰，肺泡壁稍增厚，伴少量炎性细胞浸润图 2 各组大鼠肺组织病理学改变(×200倍) Figure 2 Morphological changes were observed by HE staining among groups(×200)

图选项

2.4 各组大鼠肺组织NLRP3免疫组织化学染色结果

光镜下(200倍视野)，空气对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁薄，肺组织内几乎没有NLRP3阳性细胞。光气染毒组大鼠肺泡间隔增厚，肺组织中可见较多NLRP3阳性细胞。PDTC干预组可见大鼠肺泡结构较为清晰，肺泡壁稍增厚，肺组织中可见少量NLRP3阳性细胞。见图 3。

其中棕黄色染色为NLRP3阳性细胞图 3 各组大鼠肺组织NLRP3免疫组织化学染色(×200倍) Figure 3 NLRP3 positive cells in lung tissue were observed by Immunohistochemical staining among groups(×200)

图选项

2.5 各组大鼠肺组织NF-κB、NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达

与空气对照组比较，光气染毒组肺组织中NF-κB、NLRP3和caspase-1 mRNA表达量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与光气染毒组比较，PDTC干预组大鼠肺组织中NF-κB、NLRP3和caspase-1 mRNA表达量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。ASC mRNA表达量各组间无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。

表 2 各组NF-κB、NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA相对表达量的比较（n=6，x±s） Table 2 Comparison of the expression of NF-κB, NLRP3, ASC and caspase-1 mRNA among groups(n=6, x±s)

组别	NF-κB mRNA表达量	NLRP3 mRNA表达量	ASC mRNA表达量	caspase-1 mRNA表达量
健康对照组	0.769±0.049 9	1.458±0.004 01	1.235±0.009 66	1.464±0.005 68
光气染毒组	4.139±0.431^a	1.627±0.005 78^a	1.214±0.007 81	1.735±0.005 93^a
PDTC干预组	1.421±0.266^ab	1.593±0.012 8^ab	1.235±0.005 40	1.641±0.008 71^ab
t值	7.764^a, 5.369^b	24.07^a, 2.420^b	1.765	33.00^a, 8.877^b
P值	< 0.01^a, 0.003^b	< 0.01^a, 0.036 1^b	0.108	< 0.01^a, < 0.01^b
注：与空气对照组比较，^aP < 0.05；与光气染毒组比较，^bP < 0.05

表选项

2.6 各组大鼠肺组织NF-κB、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白含量的相对值比较

与空气对照组比较，光气染毒组肺组织中NF-κB、NLRP3和caspase-1蛋白含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与光气染毒组比较，PDTC干预组大鼠肺组织中NF-κB、NLRP3和caspase-1蛋白含量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组大鼠肺组织中NF-κB、NLRP3和caspase-1蛋白无明显改变，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。

表 3 各组NF-κB、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白含量的比较（n=3，x±s） Table 3 Comparison of NF-κB, NLRP3, ASC and caspase-1 in lung among groups(n=3, x±s)

组别	NF-κB	NLRP3	ASC	caspase-1
健康对照组	0.428±0.048 3	0.104±0.022 2	1.089±0.092 82	0.064 2±0.005 67
光气染毒组	1.137±0.051 8^a	0.722± 0.110^a	1.041±0.021 87	1.555±0.255^a
PDTC干预组	0.615±0.051 8^b	0.173±0.024 2^b	1.052±0.005 39	0.313±0.045 4^b
t值	10.02^a, 7.133^b	5.524^a, 4.887^b	0.022 19	5.848^a, 4.798^b
P值	0.000 6^a, 0.002^b	0.005 2^a, 0.008 1^b	0.892 7	0.004 3^a, 0.008 7^b
注：与空气对照组比较，^aP < 0.05；与光气染毒组比较，^bP < 0.05

表选项

2.7 血清及BALF中IL-1β、IL-18和IL-33含量的比较

与空气对照组比较，光气染毒组血清及BALF中IL-1β、IL-18和IL-33含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与光气染毒组比较，PDTC干预组大鼠血清及BALF中IL-1β、IL-18和IL-33含量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 4。

表 4 各组血清及BALF中IL-1β、IL-18和IL-33含量的比较（n=10，x±s） Table 4 Comparison of IL-1β, IL-18 and IL-33 in serum and BALF among groups(n=10, x±s)

组别	血清 IL-1β（pg/mL）	灌洗液 IL-1β（pg/mL）	血清 IL-18（pg/mL）	灌洗液 IL-18（pg/mL）	血清 IL-33（pg/mL）	灌洗液 IL-33（pg/mL）
健康对照组	35.62±1.343	169.4±3.073	37.12±1.547	47.75±2.933	12.40±1.127	20.70±1.265
光气染毒组	138.4±4.631^a	560.8±7.334^a	140.4±4.987^a	152.2±6.060^a	26.50±1.147^a	37.90±1.260^a
PDTC干预组	49.86±1.995^ab	268.9±2.609^ab	99.25±4.669^ab	87.70±5.901^ab	17.30±0.655^ab	25.70±1.230^ab
t值	21.32^a, 17.56^b	37.51^a, 24.67^b	15.51^a, 7.622^b	19.79^a, 6.28^b	8.765^a, 6.963^b	9.632^a, 6.929^b
P值	< 0.01^a, < 0.01^b	< 0.01^a, < 0.01^b	< 0.01^a, < 0.01^b	< 0.01^a, < 0.01^b	< 0.01^a, < 0.01^b	< 0.01^a, < 0.01^b
注：与空气对照组比较，^aP < 0.05；与光气染毒组比较，^bP < 0.05

表选项

2.8 TUNEL检测肺脏组织细胞焦亡

对细胞进行免疫荧光染色，荧光绿色弱，无明显细胞焦亡，细胞焦亡呈阴性；荧光绿色强，提示肺脏组织细胞焦亡明显，细胞焦亡呈阳性。结果提示空气对照组，荧光绿色弱，无明显细胞焦亡。光气染毒后可见大鼠肺脏组织荧光绿色强，细胞焦亡呈阳性。PDTC干预组大鼠肺脏组织荧光绿色弱，无明显细胞焦亡现象。见图 4。

右图为TUNEL标识、中图为DAPI标识以及左图为合并图图 4 TUNEL检测肺脏组织细胞进行免疫荧光染色 Figure 4 Pyroptosis was observed by TUNEL among groups

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3 讨论

光气经呼吸道吸入后可引起ALI，研究^[7-10]发现过度失调的炎症反应是导致急性肺损伤发生发展的重要因素——包括中性粒细胞扣押，炎症因子升高和NF-κB途径激活等，PDTC作为特异性的NF-κB抑制剂可以显著减轻肺部炎症反应。经PDTC干预后，可减轻炎症因子介导的炎症反应，减轻急性肺损伤^[6]。

NLRP3炎性小体在各种类型急性肺损伤（ALI）中扮演了重要角色^[11]，主要表达于嗜中性粒细胞、单核巨噬细胞和一些初级免疫细胞中。本研究发现在光气吸入性急性肺损伤中NLRP3炎症小体和NF-κB p65表达水平明显升高。NLRP3炎性小体激活后，其中的caspase-1活化可剪切加工无活性的proIL-1β、proIL-18和proIL-33，使其成为有生物学活性的IL-1β、IL-18和IL-33并分泌到细胞外，并引发炎症反应的瀑布效应，导致ALI甚至ARDS^[12]。其中IL-1β是极具促炎活性的炎症因子，在光气吸入中毒后2~6 h达到高峰^[7]，本实验以6 h为时间点研究NF-κB、NLRP3炎症小体及下游炎症因子是否参与光气急性肺损伤的发生。光气吸入后NLRP3炎症小体表达升高并激活，同时伴有其下游产物IL-1β、IL-18和IL-33水平升高，可以认为光气吸入后可激活NLRP3炎症小体，从而引起瀑布式的炎症反应导致ALI。光气吸入染毒经PDTC干预后，NLRP3炎症小体在肺组织中表达下降，IL-1β、IL-18和IL-33等NLRP3炎症小体的下游产物亦明显下降，提示NF-κB抑制剂可降低NLRP3炎症小体的活化，同时伴有下游炎症因子IL-1β、IL-18和IL-33水平的减少。通过研究高氧诱发的ALI小鼠模型发现，NLRP3缺陷型小鼠比野生型小鼠NF-κB表达明显减少，炎症反应抑制和肺上皮细胞凋亡减弱^[3]。体外实验证实内毒素可通过NF-κB等途径调节NLRP3的蛋白表达^[4]。因此，在光气吸入性ALI中NF-κB信号传导通路参与了NLRP3炎症小体的表达。

张克君等^[13]通过TUNEL染色检测到光气对肺上皮细胞和血管内皮细胞凋亡的诱导作用。依赖caspase-1并伴有大量促炎症因子释放为特征的细胞程序性死亡方式——近年来将其称之为细胞焦亡(pyroptosis)^[1]。随着细胞焦亡的启动，炎症小体调控的caspase-1的激活，相继出现细胞核浓集及DNA断裂等现象。由于存在DNA的片段化，焦亡细胞通过TUNEL可被DNA损伤检测方法染成阳性。焦亡现象最初是在巨噬细胞及树突细胞等髓系细胞受到病原体刺激后观察到的^[2]，煤焦油沥青烟雾提取物（CTP）可引起人支气管上皮细胞炎症凋亡，即细胞焦亡。本研究显示在光气吸入性ALI大鼠中TUNEL染色可见肺脏组织内细胞免疫荧光染色呈绿色，同时依赖caspase-1并伴有大量促炎症因子释放，提示光气吸入性ALI中存在明显的细胞焦亡现象。

在炎症损伤中可观察到NF-κB被激活，NF-κB是目前研究最多的转录调控核因子，参与调控多种炎性分子基因表达，同时也参与细胞焦亡的调节^[5]。NF-κB p65通过调节NLRP3编码基因，促进NLRP3的mRNA表达^[4]。此外，NF-κB还参与了NLRP3转录后水平的调控，促进NLRP3蛋白表达，这是NLRP3炎症小体异常表达的基础。在本研究中可观察到光气吸入后NF-κB表达明显增强。而PDTC是NF-κB信号通路的抑制剂，可抑制NF-κB的活化^[13]，干预组大鼠NF-κB表达降低，肺组织中促焦亡的caspase-1表达明显减少，肺脏组织焦亡细胞数量较光气染毒组减少。因此，PDTC通过抑制NF-κB，进而抑制NLRP3炎症小体的表达，减少Caspase-1的活化，从而明显减少肺脏组织的细胞焦亡，NF-κB参与了依赖Caspase-1介导的细胞焦亡。

志谢: 感谢复旦大学附属金山医院中心实验室老师给予的实验技术指导。

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