脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍^[1]。脓毒症引起的器官损伤, 由此发展为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 为近年来制约脓毒症治疗成功率的主要因素。微循环和线粒体窘迫综合征(microcirculatory and mitochondrial distress syndrome, MMDS)是脓毒症介导多器官损伤的病理机制之一^[2], 线粒体以多种方式调控细胞的合成和代谢功能, 它是人体内物质代谢和能量转换的中心站; 线粒体功能一旦出现障碍, 将严重影响细胞功能的正常运转, 最终导致组织、器官损伤。本文对近年来脓毒症引起线粒体损伤的主要研究进行综述。

1 线粒体膜转运功能

线粒体膜分内膜(IMM)、膜间隙和外膜(OMM)。线粒体的内外膜在不断地进行融合与分裂, 处于动态平衡状态。融合不足或过度均会造成线粒体形态变化, 不仅影响其功能, 还会促进细胞凋亡^[3]。

线粒体内膜仅对某些离子和代谢底物(相对分子质量 < 1 500)有选择性通透作用, 因此需要通过众多特异性载体蛋白协助完成物质转运。①水通道蛋白(aquaporin, AQPs)是具有高选择性和高效转运水分子的特异孔道; 不同组织、器官有不同的AQPs。如:AQP8是位于肝细胞线粒体内膜的重要水通道蛋白, 调控线粒体跨膜水转运, AQP8表达下调可引起线粒体膜电位下降及线粒体肿胀, 进而对线粒体结构产生破坏^[4]。研究发现, 脓毒症状态下, 肝细胞线粒体内膜AQP8表达量减少, 可导致ATP合成减少, 进一步引起肝细胞能量供应障碍, 导致肝细胞损伤^[5]。②腺苷酸转移酶(adenine nucleotide translocator, ANT)是内膜上的一种载体蛋白, 能准确地调控ATP和ADP之间的转换, 它负责将ATP转运离开线粒体, 并将ADP回输进来。③内膜解偶联蛋白2(uncoupling protein2, UCP2)是广泛分布于心、脑、肝、胰等脏器的质子转运蛋白。在对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的脓毒症大鼠研究中发现, 它通过解偶联作用调控线粒体膜电位, 维持ATP合成及其生物修复功能^[6]。④ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive K⁺channels, KATP通道)是一种电压非依赖性配体门控通道, 受细胞内ATP浓度、二磷酸核苷酸(NDPs)、钾通道开放剂(KCOs)、磺脲类药物(SUs)等多种因素调节启闭的钾通道。它分为位于细胞膜上的KATP(sarcolemmal KATP, sarcKATP)通道和线粒体内膜上的KATP(mitochondrial KATP, mitoKATP)通道。MitoKATP将K+转运至线粒体基质内, 并且从氧化应激、钙超载、细胞凋亡及线粒体膜通透性转换孔(mitochondria permeability transition pore, MPTP)开放等多途径对心肌细胞起到保护作用^[7]。⑤线粒体内膜上还存在众多转运体系, 如:钙转运蛋白系统通过调节线粒体内外部的钙离子(Ca²⁺)浓度, 来维持细胞、器官功能的正常运转; 呼吸链膜蛋白复合体系统通过传递电子, 完成线粒体的呼吸作用。

线粒体内、外膜之间有非特异性孔道, MPTP, 它是一种蛋白复合结构, 负责调节线粒体膜通透性, 以及线粒体内外Ca²⁺、pH和电荷的平衡; 除此之外, MPTP还担负着ATP合成、线粒体呼吸、氧化应激以及细胞凋亡等过程。Smeding等^[8]发现抑制MPTP开放能促进脓毒症小鼠心肌细胞膜电位的恢复, 可增强心肌功能, 提高心脏血流灌注, 从而降低脓毒症小鼠的病死率。有实验研究表明, 环孢素A(cyclosporine A, CsA)、新型免疫抑制剂萨菲菌素A(Sanglifehrin A, SFA)等MPTP抑制剂, 可关闭孔道, 减轻心功能损害^[9]。由此可见, MPTP的开启与关闭与其对心肌细胞的保护作用有关。

线粒体外膜上具备丰富空隙, 对小离子具有良好通透性, 可使相对分子质量低于5 000的小分子物质通过。电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel, VDAC)位于线粒体外膜, 主要承担ATP和ADP转运的功能, 保障线粒体进行正常代谢; 该通道与多种蛋白形成微结构域, 不仅是线粒体与细胞质之间进行各种代谢物质流通的重要通道, 还维持着线粒体与胞质之间的能量代谢。VDAC可以与Bax, Bcl-2, Bcl-xl相互作用, 参与细胞凋亡的调节, 同时维持钙离子的稳态, 保护线粒体正常运行。线粒体外膜上还存在一种线粒体自噬受体分子Fun 14结构相关蛋白1(Fun 14 domain-containing protein1, FUNDC1), 作用是诱导线粒体自噬, 维持细胞内线粒体数量稳定^[10]。线粒体外膜与内质网膜之间有着特殊的物理(蛋白质)连接, 称为线粒体-内质网结构偶联(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes, MAM)。MAM与钙信号调控、线粒体形态维持、内质网应激、脂质代谢、细胞凋亡、自噬体形成等过程均有密切联系。

2 线粒体内钙超载

脓毒症时, 氧自由基可引起线粒体内外Ca²⁺稳态失衡, 使胞外Ca²⁺大量内流, 造成线粒体内过量积聚, 超出了其承受范围, 产生“钙超载”^[11], 最终导致线粒体、细胞、组织功能障碍。Ca²⁺还可以激活一氧化氮(NO)合成酶, 增加活性氮和氧自由基的生成, 对线粒体膜造成损伤, 引起MPTP呈持续高通透的状态, 造成线粒体肿胀、破裂。而MPTP的开放促使细胞色素C(cytochrome C, CytC)和凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)的释放, 加快凋亡复合物的形成, 同时进一步激活Caspase 3^[12], Caspase 3是凋亡通路的最后执行者, 激活细胞内死亡级联反应, 最终发生细胞凋亡。钙超载可引发线粒体细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase, COX)功能失调和锰-超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, AdMn-SOD)的活性下降^[13], 加速氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的产生。Martin等^[14]发现过量的活性氧可引起线粒体损伤, 对细胞造成严重甚至不可逆性损害。同时活性氧的增多又促进钙超载, 两者形成恶性循环。

3 线粒体呼吸功能

线粒体呼吸链主要包含:复合物Ⅰ[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-脱氢酶]、复合物Ⅱ(琥珀酸-泛醌还原酶)、复合物Ⅲ(泛醌-细胞色素C还原酶)、复合物Ⅳ(细胞色素C氧化酶), 其主要功能是传递电子, 最终产生ATP。Ghanta等^[15]研究表明脓毒症状态下发生的氧化应激可引发线粒体功能障碍, 脓毒症时, 氧化应激产生过量ROS, 使线粒体内膜上的电子传递链受到破坏, 线粒体内复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ的活性下降, 三态呼吸耗氧量和呼吸控制率(respiratory control rate, RCR)下降, 通过抑制线粒体的呼吸功能, 导致细胞能量生成障碍。

另外, ROS进入胞质, 细胞质膜氧化酶被激活, 产生更多ROS, 进一步加重线粒体损伤, 形成了线粒体损伤-ROS-线粒体损伤的正反馈^[16]。一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)、氢类(H)、硫类(S)和其他活性氧过量产生时, 可直接抑制线粒体呼吸功能, 同时伴有线粒体蛋白质和脂膜等结构的损伤。Liaudet等^[17]通过对脓毒症幼鼠模型研究发现, 大量的炎症介质使单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等出现“呼吸爆发”, 进而影响细胞色素氧化酶C与辅酶Q的活性, 最终导致ATP生成的关键酶F1F0-ATP合酶活性下降, 以及线粒体的氧化磷酸化障碍。改善脓毒症小鼠心肌线粒体呼吸功能, 可以通过静脉注射外源性细胞色素C或使用咖啡因, 恢复ATP生成相关酶的活性得以实现, 从而提高小鼠存活率^[18]。同样, 在Martin等^[14]的研究中发现, 使用合成抗菌肽19-2.5可提高线粒体ATP含量, 减少线粒体内活性氧的产生, 进而改善线粒体呼吸功能。在脓毒症早期, 保护呼吸链复合物活性, 可改善线粒体能量供应不足的状况, 将成为治疗脓毒症或改善脓毒症患者预后的有效手段。

4 线粒体DNA

线粒体DNA(mtDNA)是由一条重链和一条轻链所构成的双链环状闭环结构, 包含了基因遗传的重要信息。mtDNA损伤会引发其转录及表达受损, 造成核编码区蛋白、4种复合酶的编码以及呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ蛋白合成降低, 破坏了呼吸链完整性, 引起线粒体功能障碍。研究发现脓毒症通过诱导mtDNA的损伤, 进一步损伤线粒体功能, 在mtDNA产生的基因突变中, 以mtDNA4977和mtDNA7436最为常见^[19]。

mtDNA对于基因突变存在较高的易向性, 且缺乏蛋白保护及自我修复能力。因此, 在脓毒症状态下, mtDNA易出现氧化损伤, Bartz等^[20]的研究验证了金黄色葡萄球菌脓毒症小鼠mtDNA损伤的设想。Cruz等^[21]推测受到氧化损伤的mtDNA进入胞质与炎症小体结合, 炎症小体是通过胞内的受体—Nod样受体家族蛋白(NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3, NLRP 3)的活化而激活。而NLRP 3炎症通路的激活, 可诱导IL 1β与IL 18的分泌增加^[22], 引起线粒体膜电位降低及呼吸功能抑制。基于上述原因因此, mtDNA基因突变和数量改变势必会降低线粒体氧化磷酸化效应, 导致ATP合成障碍。Timmermans等^[23]研究表明, 在感染性休克患者中, 血浆细胞因子浓度以及mtDNA水平在感染性休克发作时增加, 并保持升高状态。

5 线粒体损伤与细胞凋亡

线粒体是控制细胞凋亡的关键场所。线粒体诱导细胞凋亡通路是通过细胞色素C释放至胞质, 线粒体膜电位降低, 有效激活下游Caspase 9, 后者进一步有效地激活其他Caspase家族成员, 最终引发细胞凋亡^[24]。研究发现, 线粒体抗氧化物酶活性的降低、活性氧的过多产生和聚集, 引起脓毒症大鼠心肌细胞水肿和空泡变性, 随着时间延长, 脓毒症大鼠心肌核因子κB(NF-κB)的活性也逐渐增加, 均证明了线粒体损伤导致脓毒症大鼠心肌细胞的凋亡^[25]。脓毒症状态下, 线粒体融合蛋白(mitochondrial fusion protein 2, Mfn2)和线粒体分裂相关蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp 1)在过量ROS的刺激下过度表达, 产生线粒体集簇性聚集、分裂并释放细胞色素C, 进而启动细胞凋亡。连洁等^[3]检测脓毒症状态下脾淋巴细胞Mfn2蛋白表达时发现, 脓毒症时Mfn2明显降低, 抑制了线粒体融合, 导致脓毒症小鼠脾淋巴细胞凋亡。姜云龙等^[26]发现姜黄素可通过拮抗线粒体凋亡途径, 对脓毒症状态下脾脏淋巴细胞凋亡起保护作用。Bcl2原癌基因家族中的Bcl2和Bcl-XL是主要的抗凋亡因子。它们通过抑制细胞色素C释放, 使其无法激活Caspase, 进而保持了线粒体膜的完整性并维持膜电位的平衡^[27], 有效地预防了线粒体膜间隙蛋白释放, 该保护线粒体的作用也是抗凋亡的主要机制。

6 线粒体自噬

线粒体自噬是指细胞通过自噬机制, 选择性清除损伤和功能障碍的线粒体。自噬主要的生理功能是清除胞质中的变性蛋白及坏死物质, 并通过溶酶体途径降解, 实现能量的再循环, 以此来重建结构和维持细胞自身的稳定^[28]。脓毒症状态下, 细胞缺氧, 外膜上蛋白FUNDC1磷酸化的能力降低, 推动线粒体自噬发生^[10]。此外, 其他相关蛋白如Atg7、Bnip3、LC3、Nix、Ulk1、OPA1、Fis1均参与并调控了线粒体自噬。研究发现烟酰胺嘌呤二核苷通过连接ATM蛋白激酶作用, 降低线粒体膜电位, 促进线粒体自噬发生^[29]。赵品等^[30]通过腹腔注射LPS建立小鼠脓毒症模型, 脓毒症小鼠血清肌钙蛋白I(cTnI)有明显增高趋势, 而心肌细胞线粒体膜电位明显下降, 心肌细胞及其线粒体自噬蛋白LC3、Pink1、Parkin表达早期升高、随后逐渐下降, 从而推测自噬现象可能在脓毒症早期就已发生。同样用LPS诱导脓毒症小鼠模型, Piquereu等^[31]发现野生型小鼠心肌线粒体功能恢复的同时, 伴随着线粒体自噬, 表明线粒体会以自噬的方式参与心肌功能的修复。陈胜利等^[32]发现自噬可能通过限制IL-1β、TNF-α等炎症介质和ROS的产生, 降低内质网应激并阻止Ca²⁺-Mg²⁺ATP酶失活, 从而改善心肌细胞受损。线粒体自噬可以有效避免细胞、组织和器官损伤, 阻止MODS的发生。

7 结语

综上所述, 脓毒症病理过程与线粒体损伤息息相关。线粒体膜转运功能损伤, 线粒体内钙超载, 线粒体呼吸功能障碍, mtDNA损伤, 线粒体与细胞凋亡, 线粒体自噬等均参与了脓毒症介导的器官功能障碍的发生和发展。积极对线粒体功能的异常改变进行早期干预, 将会为脓毒症的治疗带来新的机遇。