百草枯(paraquat，PQ)，是一种快速灭生性除草剂。因其具有对人体的极大毒性，且目前无特效解毒药、对症治疗效果不佳，已有20多个国家禁用或者限用。我国是农业大国，百草枯应用广泛，有流行病学调查显示农药中毒中百草枯中毒最多见，占所有中毒病例的12.37%、占农药中毒病例的34.52%^[1]，其病死率居高不下, 病死率在50%~ 70%^[2-3]，中毒的严重程度与毒(药)物剂量或浓度有关，多呈剂量-效应关系^[4], 百草枯中毒已成重要的公共健康隐患。

百草枯进入人体后，主要蓄积在肺组织，其选择性聚集导致肺内浓度是血液浓度的10~90倍^[5]。因此，百草枯中毒的特征性改变是肺损伤。小剂量中毒会引起不可逆的迟发型肺间质纤维化，患者最终死亡原因是呼吸衰竭^[6]。研究表明，小剂量百草枯中毒后，肺组织内发生了上皮-间质的转化(epithelia-mesenchymal transition, EMT)，使上皮细胞转化为间充质细胞，肺组织最终发生了肺间质纤维化。上皮标记物(E-cadherin)表达的下降和间质标记物(α-SMA)表达的上升也是上皮细胞发生了上皮-间质的转化的标志^[7]。而大剂量百草枯中毒常出现(多器官障碍综合征MODS)，使患者短时间内死亡。研究认为大剂量百草枯中毒诱发了细胞凋亡^[8-10]。但凋亡的具体方式尚不清楚，具体的作用机制尚不明确。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid protease，caspase)是重要的细胞凋亡传导通路，其中caspase-8因子在线粒体和内源性凋亡途径中具有代表性，对凋亡过程有重要的调节作用^[11]，但在百草枯中毒导致的凋亡研究中暂无有关caspase-8的相关研究。

肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)(中国医大四院中心实验室)，百草枯试剂(沈阳化工研究院，中国)，MTT试剂(碧云天生物公司, 中国)，总RNA提取试剂盒(LS1030，promega, 美国)，RNA反转录试剂盒(RR036A，Takara，日本)，real-time PCR试剂盒(RR820A，Takara，日本)，caspase-3、caspase-8、caspase-9抗体(Abcam，英国)，α-SMA、E-cadherin抗体(Abcam，英国)。

肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)培养在含10%胎牛血清的F12培养基中，培养箱(37 ℃、含5%CO₂)，2 d换液一次，细胞长至80%时，予以1: 3传代处理。实验所用细胞，均为状态良好的对数生长期细胞。

收集对数期细胞，经胰酶消化离心, 调整细胞悬液浓度，96孔板铺板，细胞1×10⁴/孔。加入百草枯溶液浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mmol/L。培养24 h及48 h后观察。每孔加20C MTT溶液，继续培养4 h。每孔加入150 μL二甲基亚砜，酶标仪OD 570 nm处测吸光值。

细胞生存率计算方法：细胞存活率%=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%

检测α-SMA、E-cadherin及caspase-8、caspase-9、caspase-3的mRNA表达，GAPDH为内参。

提取RNA：胰酶消化收集细胞，500×g离心5 min，加入175 μLRNA裂解液(已加β-巯基乙醇)，转移到EP管中，加入350 μLRNA稀释液。混匀后于70 ℃加热3 min，离心机12 000~14 000×g，10 min。加入200 μL无水乙醇，转移到离心柱中，离心机12 000~14 000×g，1 min。加600 μL已加入乙醇的RNA洗液，离心机12 000~14 000×g，1 min。在吸附膜上加入50 μLDNA酶孵育混合液，室温20~25℃静置15 min。加入200 μL已加入乙醇的DNA酶终止液，离心机12 000~14 000×g，1 min。加入600 μLRNA洗液，离心1 min，加入250 μL上述溶液，离心2 min，转速为12 000~14 000×g。加入50~100 μL无核酸酶水，12 000~14 000×g离心1 min。

反转录RNA：37 ℃ 15 min(反转录反应)，85 ℃ 5 s(反转录酶的失活反应)，4℃保存。

RNA扩增后进行Real-time PCR: 95 ℃ 30 s一个循环，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。试验中使用的引物序列见表 1(南京思普金生物科技有限公司)。

取蛋白样品30 μg上样，进行SDS-PAGE电泳，80 V电泳至蛋白样品到分离胶边界，增加电压至100 V，待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源恒压。一抗封闭液稀释抗体，4 ℃过夜孵育, 用TBST洗涤膜5 min，共洗涤三次。二抗用封闭液稀释抗体，振荡孵育1h, 用TBST洗涤膜5 min，共洗涤三次, 再用去离子水洗涤3 min。将发光液A和B按照1: 1比例混合，平铺膜于保鲜膜上，将A、B混合液滴到膜上，使混合液均匀分布到膜上。暗处反应5 min，于化学放光仪上检测信号。

Western-blot结果分析测定灰度值，进行方差分析。

连续性变量符合正态分布时，采用均数±标准差(x±s)表示，不符合正态分布时用中位数及四分位数表示。多组间比较采用方差分析。计数资料采用例数(率)表示。组间比较采用χ²检验。统计学检验用双侧概率检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。数据统计分析软件采用SPSS 13.0。

首先检测0.1L~1.0 mmol/L的百草枯浓度下经过24~48 h后A549细胞的存活率，培养24 h后细胞形态发生明显变化，由梭形变为不规则形，且数量减少(图 1)，48 h后细胞变化更为明显(图 2)。培养24 h后，MTT测A549细胞随着浓度0.1，0.2，0.3，0.5，1.0 mmol/L的变化，存活率明显降低，分别为(83±1.4)%, (71±1.6)%, (65±1.8)%, (51±3.1)%, (36±1.9)%。培养48 h后，测细胞存活率，随着浓度0.1，0.2，0.3，0.5，1.0 mmol/L的变化，细胞存活率降低更为明显，分别为(76±1.7)%，(62±2.2)%，(48±2.0)%，(31±2.4)%和(22±2.5)%(图 3)。因此，在后续的试验中采用在A549细胞内加入0.1、0.2和0.3 mmol/L浓度的百草枯，共培养24 h。

图 1 与百草枯共培养24 h后A549细胞的形态变化(×40) Figure 1 The morphological changes of A549 cell with PQ for 24 hours(×40)

图选项

图 2 与百草枯共培养48 h后A549细胞的形态变化(×40) Figure 2 The morphological changes of A549 cell with PQ for 48 hours(×40)

图选项

a24h细胞存活率比较，b48h细胞存活率比较 图 3 与百草枯共培养24及48 h后A549细胞的存活率(P < 0.05) Figure 3 Survival rate of A549 cell with PQ for 24 and 48 hours

图选项

经RT-PCR检测，0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L的百草枯浓度下，培养24 h后的A549细胞中，间质标记物α-SMA及上皮标记物E-cadherin mRNA的相对表达量随浓度的增加而降低，而凋亡指标caspase-8、caspase-9、caspase-3 mRNA的相对表达量随浓度的增加而升高，见图 4。

图 4 α-SMA、E-cadherin、caspase-8、caspase-9、caspase-3的mRNA相对表达量(P < 0.05) Figure 4 Relative expression of α-SMA, E-cadherin, caspase-8, caspase-9, caspase-3 mRNA

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Western-blot中α-SMA、E-cadherin的蛋白表达量随着浓度的升高均有所下降(P < 0.05)。而caspase-8、caspase-9、caspase-3的蛋白表达量随浓度的增加而有所升高(P < 0.05)。(图 5)。

图 4 α-SMA、E-cadherin、caspase-8、caspase-9、caspase-3的蛋白表相对表达量(P < 0.05) Figure 4 Relative protein expressions of α-SMA, E-cadherin, caspase-8, caspase-9, caspase-3(P < 0.05)

图选项

尽管给予了积极治疗，仍有许多吸收大量百草枯的患者因多脏器衰竭而短时间内死亡，包括急性肾衰竭、急性肝衰竭、心肌损伤、急性肺水肿等。从一定意义上讲，大量的细胞死亡导致了组织器官的功能衰竭^[12]。细胞凋亡是一种细胞程序性死亡，对于生物的生长、发育、分化及保持内环境稳态等方面有着重要的作用。但到目前为止，细胞的凋亡过程及确切机制还不完全清楚。一些蛋白与细胞的凋亡密切相关。其中caspase家族蛋白与细胞凋亡形态学特征变化及一些生化改变关系密切^[13]。caspase分为凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子，能够触发一系列酶催化反应，致使信号逐级放大。凋亡启动因子包括能激发下游因子的caspase-2和caspase-8等，通过其他蛋白的协助，能够发生自我的激发，并且区分和激发下游的caspase。而其中的caspase-8几乎能够通过激发所有凋亡级联反应下游的caspase因子，从而诱发细胞凋亡^[14-15]。底物具有特异性，受到凋亡执行因子的作用，从而使细胞凋亡。而凋亡执行者之一的caspase-3，是细胞凋亡过程中的主要效应器，caspase-3的激活是凋亡进入不可逆阶段的标志^[16]。活化的caspase-8可以导致启动内源性的线粒体凋亡通道，主要是通过使促凋亡相关蛋白Bid裂解，而它存在于B淋巴细胞瘤-2基因家族，此时，线粒体外膜的选择透过性发生改变，使膜电位溶解，释放凋亡相关因子，caspase-9被激活，最后效应因子caspase-3被激活，最终细胞凋亡。

本实验结果显示大剂量短时间的百草枯中毒后，A549细胞的凋亡相关因子caspase-8明显升高，以及它下游因子caspase-9和caspase-3也升高。因此，本研究确认了大剂量百草枯导致A549细胞产生了caspase-8导致的凋亡; 检测百草枯中毒后A549细胞的EMT相关指标，发现在生理和病理条件下，E-cadherin表达的下降和α-SMA表达的上升是上皮细胞发生EMT的标志^[6]。研究结果出乎意料，大剂量短时间百草枯中毒时，E-cadherin表达下降的同时伴随了α-SMA表达的下降。证明该状态下，A549细胞并未发生EMT。这也是目前为数不多的研究大剂量百草枯中毒后，下调EMT相关标记物变化的研究。有些研究认为E-cadherin的缺失是凋亡细胞的一个特征，而同时伴有α-SMA的表达量减少是凋亡的一个重要特征。因此，大剂量短时间暴露于百草枯后，α-SMA、E-cadherin表达量的下降与EMT无关，更倾向于细胞凋亡所致。