缺血性脑白质损伤是引起大脑功能障碍的主要原因^[1]。脑白质主要由被髓鞘包覆的神经轴突组成, 其中少突胶质细胞形成的髓鞘是构成脑白质的重要功能成分之一。研究表明^[2]，不仅神经元对缺血、缺氧敏感，构筑脑白质的神经纤维及少突胶质细胞对此也很敏感。由于脑白质主要控制神经元之间讯号共享, 协调各脑区之间的正常运作，如果少突胶质细胞在疾病过程中得不到有效保护，其缺血性损伤导致的脱髓鞘病变可能使髓鞘包绕的轴突出现严重功能障碍，继而影响相应功能支配。

本研究所采用的DTI成像技术，是基于常规MRI和弥散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI)技术改良而成的一项新的无创成像技术。其中，弥散张量纤维束成像(diffusion tensor tractography, DTT)是DTI技术的进一步延伸，其通过计算机软件与DTI成像技术结合，把DTI数据进行重组，形成三维图像，从而可立体直观地对神经纤维走向、空间位置、数量以及纤维间的连接关系进行评估，并结合实际情况，进行个体化治疗。DTI成像技术可通过检测活体组织内水分子的随机运动情况, 提供关于神经纤维的完整性以及相应病理性改变的信息^[3-4]。在中枢神经系统，走行方向高度一致的脑白质纤维束的水分子扩散具有各向异性，任何能改变组织完整性、细胞外间隙和神经元大小的病理过程均可引起组织的扩散变化。理论上脑白质水分子弥散异常可以反映扩散屏障(如轴索、髓鞘、少突胶质细胞)的微小病变，使活体水平评估缺血性脑损伤微结构病变成为可能^[5]。因此，本研究应用小动物MRI的DTI成像探讨缺血-再灌注损伤后脑白质病变的情况，为缺血-再灌注损伤的机制研究提供神经影像学基础。

健康雄性清洁级SD大鼠，体质量(230±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[(SCXK(沪)2012-0002)]。在福建医科大学实验动物中心SPF级动物实验室进行适应性喂养，模拟标准日夜系统，予以自由饮食及饮水，体质量达(260±20)g时进行实验研究。

24只健康SPF级大鼠采用随机数字表法，将大鼠分为2组，假手术组和模型组，每组各12只。

各组大鼠术前24 h禁食，不禁水。采用改良的Koizumi等^[6]方法制备局灶脑缺血-再灌注损伤模型，具体造模过程如下：大鼠经腹腔麻醉，先处于俯卧，矢状位剪开额顶部皮肤约2 cm，暴露皮下筋膜，并用浸满双氧水的棉签进行消毒擦拭，直至暴露出颅骨前囟及左侧颅骨一半。将激光多普勒血流仪的探头固定于前囟左5 mm，后3 mm定位点上，记录左侧大脑中动脉供血区域血流变化值，当所示数值平稳，开始制作MCAO模型，仰卧位固定大鼠，切开颈部皮肤，分离筋膜和下方肌肉，暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉及其深部分支翼腭动脉。依次结扎颈总动脉近心端、颈外动脉远心端，并于颈内动脉下方穿线预留结扎，用微动脉夹夹闭远端颈内动脉，距颈总动脉分叉5 mm处用显微剪刀剪一“Ⅴ”型切口，并将已备好的侵泡生理盐水的线栓用显微镊插入颈内动脉至有少许阻力止，分叉处起计算插入约18~22 mm，线栓到达大脑中动脉分支处，此时显示屏示血流下降至基础值的10%~20%^[7]，即为栓塞成功，再固定线栓，颈部伤口常规缝合。2 h后再灌注时，轻柔回抽线栓至颈总动脉分叉处。术中和术后保持室温25℃左右，用白炽灯照射动物，使其肛温维持在(37±1)℃，直到苏醒恢复活动，给予正常饮水、饮食。假手术组只分离动脉，不结扎、插线。

(1) 采用Zea longa评分法^[8]，根据造模后大鼠出现的神经功能缺损症状分为0~4分，1~3分说明模型成功，0分、4分予以剔除。0分：无神经功能缺损；1分：提尾时右前肢内收，不能完全伸展；2分：自发行走时向右侧转圈；3分：行走时身体向右侧倾倒；4分：不能自发行走，有意识丧失。(2)采用改良神经功能缺损程度评分方法(modified neurological severity scores，mNSS) ^[9]，所有大鼠在术后2 h，干预后7 d和14 d分别进行mNSS评价。所有操作由2名研究人员分别单独进行评分，并取平均值。mNSS主要包括：大鼠运动、感觉、平衡及反射4个方面的评价。正常为0分，评分越高，损伤越严重，缺损最重为18分。

采用Rotarod平衡运动转棒仪测试大鼠运动协调能力。采用加速运动的方法，开启电源转轮匀速后，开始加速，5 min内由每分4转加速到40转，每天2次，每只3次重复测试，每次间隔15 min ^[10]。手术前3 d为训练实验，将大鼠置于转杆上，大鼠在转杆上爬行开始计时，大鼠从转杆跌落至脚踏板上，自动停止计时，记录大鼠在转杆上停留的时间。MCAO后7 d及14 d进行运动功能恢复测试试验，rotarod运动测试数据表示为3次实验平均值与自身对照基线值的百分比。

造模14 d后各组大鼠依次麻醉后，使用7.0T MRI扫描仪(Bruker Medizintechnik，Germany)进行扫描。扫描图像包括定位图，T2W1图及DTI图。T2W1采用弛豫增强快速采集序列，具体参数如下：FOV=32 mm×32 mm，矩阵为256×256，TR=4 200 ms，TE=35 ms，层厚1 mm，扫描层数21层。DTI序列采用单次激发自旋平面回波序列(SE-EPI)，弥散敏感梯度为非共线且非共面的30个梯度方向，b=1 000 s/mm²，同时包括5个b值为0 s/mm²的DTI图像，层厚1 mm，扫描层数21层，TR=7 500 ms，TE=45 ms，FOV=32 mm×32 mm，矩阵为64×64，总时间为52.5 min ^[11]。

T2W1所获得的原始数据通过Image J软件进行脑梗死体积的计算。方法为：计算每层脑梗死的体积(每层脑梗死的面积×1 mm)，每个脑组织的脑梗死总体积即所有层面脑梗死体积之和，脑梗死百分比为脑梗死体积与全脑体积的比^[12]。DTI所获得的原始数据传入第三方软件Diffusion Toolkit工作站，利用TrackVis图像处理软件生成每个体素的DTI参数图及纤维追踪图，把DTI图像和T2WI横断面层面进行匹配，并结合大鼠脑立体定位图谱，确定感兴趣区(region of interest，ROI)感觉运动区、纹状体区，即冠状位距前囟2 mm层面，测量像素区为3 mm×3 mm×1 mm，分别测量各组大鼠患侧缺血区及对侧相应ROI区域(感觉运动区、纹状体区)的神经纤维数目，同一层面(即冠状位距前囟2 mm层面)缺血侧感觉运动、纹状体区神经纤维数目/对侧神经纤维数目，即相对神经纤维数目。

采用尼氏(Nissl)染色观察运动和纹状体区神经细胞完整性。步骤：按0.01 mL/100 g腹腔注射80 mg/mL戊巴比妥钠麻醉大鼠，取6只小鼠以0.9%氯化钠进行心脏灌注，待将循环血液基本冲洗出后，于左心室灌注入4%多聚甲醛进行固定，随后，取出大脑组织，将其浸没于预冷的4%多聚甲醛内固定，置于4℃环境24 h。大脑样本后取出进行石蜡包埋，将包埋好的组织块切成5 μm厚度的石蜡切片，切片置于37℃恒温箱过夜，切片取出后放入60 ℃烤箱烤片30~40 min，分别浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡约15 min，而后按100%Ⅰ、100%Ⅱ、100%Ⅲ、95%、80%、70%酒精浓度梯度入水处理，每个浓度梯度5 min，再入纯水洗涤5 min，之后浸入尼氏染色染料6~10 min，纯水洗脱，再度置于60℃烘干，树脂封片。使用光学显微镜观察大鼠缺血侧运动区和纹状体神经元细胞(放大倍数，400×)，使用Image-pro plus分别计数此两区内随机三个视野下神经元细胞的个数。

所有实验数据采用统计软件SPSS 18.0处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组均数组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

脑缺血-再灌注损伤大鼠2 h后出现不同程度的神经功能缺损，Zea-Longa评分、mNSS评分显示1 d、7 d和14 d后缺血-再灌注损伤大鼠逐渐降低，提示缺血-再灌注损伤大鼠随时间其神经缺损功能逐渐自愈恢复(P < 0.05)。见表 1、表 2。

Rotarod实验中，大鼠在转棒中停留时间与其自身基线的比值进行分析。如表 3显示，与假手术组比较，模型组大鼠缺血-再灌注后7d和14d均在转棒上的停留时间明显缩短(P < 0.01)。

缺血-再灌注损伤14 d后各组大鼠进行DTI成像，如图 1所示，假手术组大鼠神经纤维分布完整，可见明显的胼胝体纤维，左右神经纤维分布均匀、对称。模型组大鼠左侧神经纤维明显缺失，左右横向神经纤维明显减少。进一步缺血侧感觉运动区-纹状体神经纤维连接分析显示(图 2)，假手术组大鼠可见清晰的感觉运动区到纹状体的神经纤维连接，而缺血-再灌注损伤后，模型组大鼠神经纤维连接的数量明显减少。

图 1 各组大鼠神经纤维分布 Figure 1 The distribution of cerebral white matter nerve fibers

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ROI区域为感觉运动区(蓝色球)，纹状体区域(红色球) 图 2 各组大鼠缺血侧运动-纹状体纤维追踪 Figure 2 The neural fiber tracking of ischemic motor to striatum region in groups

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Nissl染色结果显示(图 3~4)，假手术组细胞形态完整，排列整齐，轴突较长而完整；缺血-再灌注损伤14 d后，模型(MCAO)组大鼠缺血侧感觉运动区皮质及纹状体区神经元结构不清，部分胞质自溶，颗粒脱失，胞核变性呈三角形或碎裂消失，尼氏小体含量减少。

图 3 缺血侧运动区Nissl染色 Figure 3 The Nissl staining in the ischemic motor area

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图 4 缺血侧纹状体区Nissl染色 Figure 4 The Nissl staining in the ischemic striatum

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目前DTI技术被广泛应用于临床试验研究，急性脑卒中后肢体运动功能障碍患者发病1周内病灶区平均FA值较健侧相应部位降低^[13]，亚急性期，起病1月病灶侧FA值和3月时病灶侧FA值均明显低于非病灶侧，亚急性期脑卒中患者DTI改变可以量化评价远期的运动损伤程度，与起病后1月的DTI数据相比，起病3月的DTI数据更能有效地预测亚急性期脑卒中患者的总体预后和生活自理能力^[14]。动物模型上相对较少，Bracko等^[15]应用DTI技术评价硝基丙酸预处理对MCAO模型的作用，发现ROI胼胝体区下行皮质脊髓束损伤较模型组减轻，FA值增高并伴随mNSS运动感觉评分降低及运动行为学胶带移除检测改善。

DTI可通过对活体组织内水分子的随机运动进行显影, 提供关于神经纤维完整性及是否存在相关病理变化的信息^[3-4]。缺血性脑卒中后，神经元死亡，神经纤维变性坏死。Pantoni等^[16]研究发现大鼠大脑中动脉闭塞不同时期，离体大脑白质的组织学结果，在光镜和电镜下呈现一系列的动态变化：缺血30 min，星形胶质细胞和少突胶质细胞开始肿胀；缺血3 h，大量少突胶质细胞表现出不可逆损伤的改变；缺血6 h，基底核神经细胞出现坏死；缺血24 h，40%神经细胞苍白并伴有白质空泡化，有髓轴索节段性肿胀，髓鞘内分层形成腔隙，星形胶质细胞突起水肿。一方面，小胶质细胞参与脑缺血急性期的主要炎症免疫反应。急性缺血后，脑白质区的小胶质细胞被大量激活，并释放大量细胞毒性因子，其引发的炎症免疫反应明显强于灰质区。同时，小胶质细胞还承担吞噬和清除变性神经组织的职能。另一方面，与神经元细胞不同，胶质细胞受损之后仍具有较强的再生能力，在室管膜周围存在少突胶质细胞前体细胞，一定条件下这些少胶质细胞还可以进行增殖、分化并迁移至受损区域起修复的作用^[15]。本实验发现脑缺血-再灌注损伤大鼠2 h后出现不同程度的神经功能缺损，Zea-Longa评分、mNSS评分显示1 d、7 d和14 d后缺血-再灌注损伤大鼠评分逐渐降低；缺血-再灌注后7 d和14 d后大鼠均在转棒上的停留时间明显缩短；缺血侧神经纤维明显缺失，左右横向神经纤维明显减少。感觉运动区-纹状体神经纤维连接的数量明显减少，与感觉运动区和纹状体神经元病理坏死结果一致。这些结果提示缺血性脑卒中模型大鼠恢复期神经纤维完整性得到一定程度的自愈，同时为进一步缺血性脑卒中后的深入细胞分子生物学研究提供研究基础，也为临床上运动神经纤维损伤与治疗的观察提供时间窗。