2017, Vol. 26
心搏骤停(CA)是威胁人类健康的重要死因之一[1-2]，自主循环恢复(ROSC)后的心功能不全(PRMD)在临床中往往难以纠正，成为最初心肺复苏成功后高病死率的重要原因[3-5]。ROSC后心功能不全是心肺复苏中全心缺血-再灌注损伤引起的心肌顿抑现象。有多种因素涉及心肌顿抑的发生，氧化应激损伤是被普遍认可的机制[6]。亚低温治疗(MTH)是目前唯一被证实能够改善心搏骤停复苏后机体的神经功能和存活率的临床治疗措施，也是目前最有效的复苏后干预策略之一[7-8]。以往的大型动物研究证实MTH治疗能改善复苏后的心脏功能[9]，但是亚低温治疗对复苏后心功能不全的影响及其作用机制尚未完全明确。
由于线粒体是能量供应以及氧化应激攻击的主要细胞器之一，因此本研究拟通过建立心搏骤停与复苏的动物模型，研究亚低温治疗对ROSC后心肌线粒体氧化应激的影响，探讨亚低温治疗有效改善复苏后心脏功能的机制。
1 资料与方法 1.1 动物准备本实验在中山大学卫生部辅助循环重点实验室进行。18只成年雄性Wistar大鼠，由中山大学实验动物中心提供。动物购进后在SPF级动物房饲养1周，实验前晚禁食不禁水。动物麻醉：戊巴比妥钠(Sigma公司，德国)30 mg/kg，由耳缘静脉注入，酌情给予1/4的首剂量维持。
1.2 动物模型建立按照笔者前期的方法建立室颤心脏骤停CPR模型[10]，诱发室颤成功的标准为动脉搏动消失、血压迅速下降接近0 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，心电图显示室颤波形持续室颤5 min后开始心肺复苏(CPR)，先给予2 min的心前区胸外按压按压频率200次/min，按压深度为前后胸径的l/3，同时给予肾上腺素20 μg/(kg·min)按压2 min后给予10 J的能量除颤(Cardiopace除颤仪)，所有的胸外按压均由同一实验人员实施。反复进行上述CPR周期，如15 min未出现ROSC，宣布复苏失败。ROSC的标准为恢复室上性心率，平均动脉压＞60 mmHg持续10 min以上。
1.3 实验分组和温度控制18只Wistar大鼠根据随机数字法分为2组: ① 常温治疗组(NORM组), ROSC后放置在37℃恒温箱内维持核心温度在正常范围内，② 亚低温治疗组(hypothermia组)，按照笔者前期的研究方法, 在动物体表放置冰块诱导亚低温和维持亚低温[11]。本实验中动物的核心温度鼓膜温度的正常范围为(39.5±0.5)℃，目标温度为33 ~35 ℃达到目标温度后维持亚低温治疗。
1.4 检测目标、标本留取及检测方法实验过程中记录基础生命支持(BLS)的时间、肾上腺素用量以及除颤次数；心脏彩超(超声心脏彩超HD11XE，飞利浦超声系统，美国)检测两组动物ROSC后1~4 h的心脏射血分数(EF)、缩短分数(FS)和每搏输出量(SV)等心脏功能变化；以及电子显微镜下心肌线粒体超显微结构的变化。
分别在ROSC后1 h、2 h与4 h各留取左心室心尖部心肌，以冰生理盐水冲洗，经差速离心法提取心肌均浆蛋白，分别检测心肌细胞内谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)与三磷酸腺苷(ATP)含量；另取1 mm×1 mm×1 mm大小心肌组织，用4℃预冷2%戊二醛溶液进行固定，采用双片染色，根据Flameng评分标准在透射电镜下观察线粒体损伤程度并评分[12]。
1.5 统计学方法实验结果采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 基本生理参数两组大鼠的体质量、体温差异无统计学意义；两组动物在CPR过程中，BLS时间差异无统计学意义(P＞0.05)；两组肾上腺素的用量差异无统计学意义(P＞0.05)、电击除颤的次数差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 1。
| 组别 指标 | 数值 |
| NORM组 | |
| BW(g) | 426.0±41.4 |
| T(℃) | 37.5±1.1 |
| E(μg) | 747.6±168.4 |
| DF(times) | 2(1, 3) |
| BLS(Minutes) | 4.5±0.8 |
| Hypothermia组 | |
| BW(g) | 437.0±52.9 |
| T(℃) | 37.1±0.8 |
| E(μg) | 742.5±166.6 |
| DF(times) | 1(1, 3) |
| BLS(Minutes) | 4.6±0.8 |
| 注：BW=Body Weight；T=Temperature; E=Epinephrine; DF=Defibrillation times; BLS=Base life support. | |
两组动物心脏超声提示，MTH治疗能够提高射血分数(EF)、缩短分数(FS)和每搏输出量(SV)，见图 1。
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| ROSC后4h亚低温治疗组Wistar大鼠的EF值、FS值和SV均显著高于常温治疗组；a表示和常温治疗相比，P＜0.05 图 1 ROSC后亚低温治疗改善Wistar大鼠心功能 Figure 1 Mild hypothermia therapy improvesin in Wistar rat cardiac function after ROSC |
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ROSC后亚低温组1 h、2 h和4 h心肌内ATP含量分别为(54.44±3.83)、(41.71±9.27) 和(40.52±8.78) mmol/L，常温治疗组ROSC后1 h、2 h和4 h心肌内ATP含量分别为(54.54±4.23)、(24.51±9.69) 和(29.88±8.45) mmol/L，亚低温治疗组ROSC后2 h和4 h心肌内ATP含量显著高于常温治疗组，而AMP、ADP含量两组之间差异无统计学意义，见表 2。
| 组别 | ROSC 1 h | ROSC 2 h | ROSC 4 h |
| NORM组 | |||
| AMP | 21.37 ±1.76 | 16.59 ±8.14 | 22.89 ±10.42 |
| ADP | 120.63 ±21.31 | 89.77 ±33.05 | 93.48 ±26.92 |
| ATP | 54.54±4.23 | 24.51±9.69 | 29.88±8.45 |
| ATP/ADP | 0.47±0.12 | 0.28±0.07 | 0.34±0.13 |
| ATP+ADP+AMP | 196.54±19.64 | 130.87±47.42 | 146.24±32.77 |
| Hypothermia组 | |||
| AMP | 21.14±5.44 | 23.63±17.59 | 19.50±3.21 |
| ADP | 121.09±12.12 | 112.54±36.89 | 87.38±21.41 |
| ATP | 54.44±3.83 | 41.71±9.27a | 40.52±8.78a |
| ATP/ADP | 0.42±0.03 | 0.39±0.11 | 0.46±0.18 |
| ATP+ADP+AMP | 202.23 ±7.13 | 177.88±51.45 | 153.84±34.40 |
| 注：与NORM组比较，P＜0.05；a表示P＜0.01 | |||
ROSC后2 h亚低温治疗组心肌内GSH含量为(4.15±0.14) mmol/L，常温治疗组为(4.34±0.74) mmol/L两组之间差异无统计学意义；而ROSC后4 h亚低温治疗组心肌细胞内GSH含量为(17.12±3.99) mmol/L显著高于常温组的(13.38±2.19) mmol/L。ROSC后2 h和4 h亚低温治疗组心肌内MDA含量分别为(0.54±0.04) 和(0.84±0.05) mmol/L，显著低于常温治疗组的(0.83±0.09) 和(1.00±0.09) mmol/L，见图 2。
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| 图 2 ROSC后亚低温治疗对心肌内GSH和MDA含量的影响 Figure 2 Effect of mild hypothermia therapy on the GSH and MDA content of myocardial after ROSC |
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ROSC后4 h心肌超微结构变化，NORM组心肌线粒体弥漫性肿胀、线粒体棘模糊，心肌纤维肿胀，而Hypothermia组动物心肌纤维损伤减轻，肌纤维结构清晰，线粒体轻度肿胀、内部结构清晰，见图 3。
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| 图 3 透射电镜观察两组动物ROSC后4 h心肌超微结构的改变(醋酸铀-柠檬酸铅双染×10 000) Figure 3 Tem observation the changes of myocardial ultrastructure between the two groups animals after ROSC 4 h(×10 000) |
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NORM组心肌细胞排列不规则，线粒体聚集，分布紊乱、插入心肌肌节，形态异常，线粒体嵴肿胀；Hypothermia组心肌细胞排列尚规则，线粒体出现聚集现象，主要分布于心肌肌节周围，形态不规则，线粒体嵴轻度肿胀。线粒体损伤评分：0.21±0.04vs. 0.42±0.07，P＜0.05。
3 讨论目前认为ROSC后心功能不全(PRMD)是导致初始复苏成功患者早期死亡的主要原因。CA后CPR过程本质上是全身缺血再灌注损伤的过程，在心搏骤停后数分钟内即出现线粒体氧化磷酸化功能下降、细胞色素C缺失、活性氧(ROS)增多及由于酪氨酸硝基化造成的线粒体蛋白氧化等改变，说明线粒体功能障碍在心搏骤停CPR后的病理变化机制中起关键作用。同时CA-CPR后因缺血、再灌注、能量供应急剧减少等原因引起线粒体超微结构改变，线粒体是真核细胞氧化磷酸化产生ATP的重要场所，为生命活动提供约95%的能量，其功能主要是调控细胞能量代谢和凋亡通路。
CPR后最初数分钟内即出现的氧自由基代谢紊乱及线粒体能量合成障碍是导致心肌缺血-再灌注损伤(I/R)的重要原因之一[13-14]。有实验在CPR犬模型中可以观察到，CPR组心肌丙二醛(MDA)明显增高，超氧化物歧化酶(SOD)活性降低。减轻复苏后心肌结构及功能的损伤一直是提高复苏存活率的研究重点[15]，尤其是线粒体在I/R后呼吸爆发，产生大量ROS，并攻击膜结构产生过量的MDA，进一步损伤细胞结构与功能，所以ROS的异常增加标志着线粒体氧化磷酸化功能障碍[16-17]；成功复苏后产生的氧化应激过程中线粒体ROS大量生成，破坏线粒体的结构和功能，抑制ATP生成，并形成恶性循环[18]。并启动细胞凋亡使心肺复苏后心肌细胞膜的功能受损及完整性遭到破坏，细胞核变性、坏死。另外在氧化应激过程改变线粒体膜通透性，破坏线粒体内外膜、线粒体嵴等膜结构，影响线粒体功能，抑制ATP生成，并形成恶性循环[13]。氧自由基与细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，最终分解为MDA。MDA会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有细胞毒性，其含量能反映氧化应激程度。改善线粒体功能是减轻心肌I/R损伤的重要途径[19-20]。
本项研究发现，亚低温治疗干预能够显著降低心肌细胞内丙二醛(MDA)含量、提高谷胱甘肽(GSH)含量，提示亚低温可以通过抑制脂质过氧化过程，提高内源性抗氧化酶活性，抑制氧自由基过多产生和脂质过氧化产物堆积，明显增加心肌对缺氧的耐受，减轻氧自由基对心肌细胞的损伤，保护心肌细胞；本项研究还发现，亚低温组心肌细胞内三磷酸腺苷(ATP)含量较常温对照组显著，说明线粒体功能得到保护。透射电镜下发现心肌超微结构，常温对照组心肌线粒体弥漫性肿胀、线粒体棘模糊，心肌纤维肿胀，而亚低温组动物心肌纤维损伤减轻，肌纤维结构清晰，线粒体轻度肿胀、内部结构清晰，因此提示亚低温能够一定程度上维护心肌线粒体结构与功能的稳定。另外，两组动物ROSC后的心功能对比提示亚低温治疗组显著优于常温对照组，表明ROSC后亚低温治疗可以显著提高实验动物的射血分数(EF)、缩短分数(FS)和心输出量(SV)等心功能。
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