全球范围内,脓毒症以及脓毒症性休克每年影响着数百万人的健康[1]。血管内皮屏障功能障碍在脓毒症发生发展过程中发挥关键作用[2]。脓毒症发病过程中往往出现体腔及组织水肿,引起组织缺氧以及有效循环血量不足,严重者可导致多器官功能衰竭[3]。肺是脓毒症时最易受累的器官,可引起急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)[4-5]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要组成部分,是脓毒症发生的关键因子[6]。本课题组既往应用脓毒症大鼠模型对多药耐药相关蛋白4(multidrug resistance-associated protein 4,MRP4)。研究发现,应用MRP4抑制剂可以显著减轻脓毒症大鼠相关肺损伤。然而,MRP4对脓毒症急性肺损伤的作用机制尚未完全阐明。本实验通过重组腺病毒载体介导的针对大鼠MRP4基因设计的短发夹RNA (Ad-shMRP4),体外感染大鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs),观察MRP4基因沉默对LPS诱导的细胞通透性及细胞骨架的影响,进一步明确MRP4调节脓毒症内皮屏障功能障碍的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料大鼠PMVECs细胞株购于(北京北纳创联生物技术研究院);重组腺病毒Ad-shMRP4(针对大鼠MRP4基因设计的shRNA-MRP4靶基因片段5’ -GAGAAGTCATTCGCCGACCTCATAA-3’)构建、包装、扩增、鉴定以及纯化,最终得到滴度为1×1010 pfu/mL的Ad-shMRP4和腺病毒空白载体Ad-shRNA(均带有绿色荧光蛋白基因; 由上海汉恒生物科技有限公司完成);RPMI1640培养基及胎牛血清均购于Gibco公司(美国);LPS及辣根过氧化物酶(HRP)均购于Sigma公司(美国);Transwell小室购于Corning公司(美国);FITC-鬼笔环肽染色剂、抗荧光淬灭封片剂封片均购自武汉谷歌生物科技有限公司。
1.2 PMVECs培养使用0.25%胰酶+乙二胺四乙酸(EDTA)消化PMVECs后种植于含10%血清的RMPI1640培养基中,置于细胞培养箱中培养(培养条件:37 ℃、5%CO),待细胞长至80%~90%进行消化传代。
1.3 重组腺病毒感染PMVECs消化培养内细胞,按照每孔1×105个将细胞接种在6孔板中,待细胞融合至80%左右。按MOI(感染复数)值=50计算感染所需的病毒量,将所需的病毒加入6孔板并补充1 mL完全培养基,充分摇匀后,置于细胞培养箱,感染2 h后换液,感染24 h后,荧光显微镜下观察感染效果。
1.4 实验分组本实验随机将6孔板内的细胞分为4组:对照组不接受任何处理,只加入等量培养基;LPS组细胞仅接受10 μg/mL LPS刺激;Ad-shMRP4组是指带有绿色荧光蛋白以及特定针对大鼠MRP4基因设计的短发夹RNA重组腺病毒,感染细胞24 h后,再接受10 μg/mL LPS的刺激;Ad-shRNA组细胞的处理因素为带有绿色荧光蛋白基因空白腺病毒载体,感染细胞24 h后,接受10 μg/mL LPS刺激。
1.5 Western blot检测MRP4的表达水平吸取细胞培养基,用4 ℃的PBS清洗3次,放置在冰上,加入RIPA裂解液(10 μL/mL)和蛋白酶抑制剂PMSF(20 μL/mL)。冰上放置30 min,通过细胞刷将6孔板上贴壁细胞刮下收集后行超声破碎细胞(30 s),置于4 ℃环境下以12 000 r/min离心10 min后,收集样本上清液,并使用20 μL行BCA检测样本蛋白浓度,剩余按照1: 4加入5×SDS上样缓冲液,经过100 ℃恒温煮沸5 min。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。TBS-T洗涤,室温封闭(5%脱脂奶粉,TBS-T)1 h,以兔抗鼠MRP4单克隆抗体(1: 1 000稀释,Cell Signaling Technology公司,美国)4 ℃孵育过夜,TBS-T洗涤,加入山羊抗兔多克隆荧光二抗(1: 15 000稀释,LI-COR公司,美国)室温避光孵育1 h,TBS-T洗涤,以β-actin为内参(兔抗鼠β-actin多克隆抗体1: 1 000稀释,武汉谷歌生物有限公司)。Odyssey双色红外激光扫描成像系统扫描分析蛋白条带,以目的蛋白条带与内参条带的灰度值比值反映目的蛋白表达水平。
1.6 Transwell小室法检测内皮细胞通透将300 μL的PMVECs以5×104个/孔的细胞密度种于transwell (直径6.5 mm,横径0.4 μm)上室,下室加入1 mL含10%血清的培养基,待细胞长满后;上室10 μg/mL LPS和1 μg/mL HRP总量共300 μL,下室加入1 mL完全培养基。分别在0、2、6、12、24 h从下室取100 μL(并用完全培养基补充),置于96孔板中,待样本收集完成后,每孔加入TMB显色液100 μL,室温避光30 min后通过酶标仪在450 nm波长处检查HRP吸光度,判断PMVECs的通透性。
1.7 PMVECs纤维状机动蛋白(F-actin)免疫荧光染色将细胞种植于载玻片上,待细胞融合至50%左右, 给予磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,4%多聚甲醛固定15 min,PBS冲洗后,1 %Triton-PBS破膜5 min,PBS冲洗后加入FITC-鬼笔环肽染色剂PBS 1: 300稀释,室温避光染色1 h后,PBS冲洗后,抗荧光淬灭封片剂封片,共聚焦荧光纤维镜下观察F-actin分布。
1.8 统计学方法计量资料采用SPSS 19.0进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用重复测量资料方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PMVECs形态以及感染率大鼠PMVECs呈梭形、椭圆或多边形,细胞质丰富,可见典型“铺路石样”排列生长(图 1A)。重组腺病毒在MOI值=50时,对大鼠PMVECs的感染率约为95%(图 1B)。
2.2 MRP4蛋白的表达水平检测与对照组相比,其余组蛋白表达水平显著上调(P<0.05);与LPS组比较,Ad-MRP4组蛋白表达水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。见图 2。
2.3 基因沉默MRP4对内皮细胞通透性的影响大鼠PMVECs在10 μg/mL LPS的刺激下,细胞通透性在2 h增加,并逐渐升高,12 h达到高峰,24 h开始下降。与对照组比较,内皮细胞通透性在LPS组、Ad-shMRP4组和Ad-shRNA组从2 h至24 h都显著增高(P < 0.05)。与LPS组比较,内皮细胞通透在Ad-shMRP4组2、6、12和24h明显降低(t=6.36, 8.85, 9.15, 12.91, 均P < 0.05);内皮细胞通透性在LPS组和Ad-shRNA组相比在0, 2, 6, 12和24 h差异无统计意义(t=0, 0.87, 0.25, 0.70, 均P>0.05),见表 1。
组别 | 样本数 | 0 h | 2 h | 6 h | 12 h | 24 h |
对照组 | 10 | 0.23±0.03 | 0.28±0.02 | 0.30±0.01 | 0.33±0.04 | 0.32±0.03 |
LPS组 | 10 | 0.25±0.03 | 0.41±0.04 a | 0.53±0.04 a | 1.12±0.17 a | 0.79±0.02 a |
Ad-shRNA组 | 10 | 0.25±0.03 | 0.41±0.03 a | 0.52±0.03 a | 1.10±0.18 a | 0.80±0.04 a |
Ad-shMRP4组 | 10 | 0.24±0.02 | 0.32±0.02 ab | 0.39±0.03 ab | 0.70±0.07 ab | 0.57±0.05 ab |
注:与对照组比较,aP<0.05;与LPS组比较,bP<0.05 |
对照组PMVECs内F-actin主要分布在细胞周边、微丝分布有序、连续完整、有少量的应力纤维,其余组内皮细胞内可见F-actin排列紊乱、断裂、重构、应力纤维形成。Ad-shMRP4组内皮细胞F-actin破坏程度较LPS组及Ad-shRNA组明显减轻(图 3)。
3 讨论目前脓毒症的发病率和病死率依然居高不下,据统计仅在美国每年需要花费数百亿美元[7]。急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征是脓毒症患者常见并发症,现今仍然缺乏特效的治疗措施,其病理特征主要为微血管内皮细胞通透性增高,导致肺水肿、透明膜形成,严重者可伴有肺间质纤维化[8]。正常情况下微血管内皮细胞具有调节血管张力、维持血管屏障,防止炎症细胞、血细胞渗出以及微血栓的形成,是维持器官功能的要素之一[9]。因此,探索脓毒症时血管内皮细胞的保护因子对脓毒症治疗起着关键作用。随着对细胞骨架研究的不断深入,有学者提出Rho家族的GTP酶参与了炎症介质所致的细胞通透性的调控,其通过内皮细胞骨架重构来调节细胞间的连接,从而发挥作用[10]。Rac1是Rho家族的GTP酶成员之一,目前研究证明,激活Rac1可加强内皮细胞微丝骨架连接的牢固性,有助于维持稳定的细胞屏障功能。某些病理因素引起Rac1失活,可导致血管内细胞骨架破坏,从而引起内皮细胞通透增加[11]。
LPS是革兰阴性菌细胞壁主要成分[6],是导致脓毒症发病始动因素[12]。目前有关LPS导致血通透性增加的具体机制尚未明确,可能与其引起炎症介质释放导致内皮受损以及通过激活细胞内相应信号通路导致细胞骨架解聚、重构有关[13]。Mckenzie和Ridley[14]研究发现,LPS通过降低细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的水平诱导Rac1失活。因此,理论上增加血管内皮细胞内cAMP的水平可提高Rac1活性,从而起着稳定血管内皮屏障的作用。MRP4是体内最大跨膜转运蛋白家族成员,通过水解ATP调节多种物质的跨膜转运[15]。Moon等[16]研究证实,应用MRP4抑制剂可升高内皮细胞内cAMP水平。此外,Belleville-Rolland等[17]研究显示,沉默MRP4基因引起大鼠心室细胞内cAMP水平升高。本实验结果表明,Ad-shMPR4组大鼠PMVECs的通透性以及细胞骨架的破坏程度较LPS组和Ad-shRNA组明显减轻,表明沉默大鼠MRP4基因对LPS造成的大鼠PMVECs的损伤具有保护作用。笔者推测沉默MRP4基因对内皮细胞的保护作用机制与增加细胞内cAMP水平,从而改善Rac1活性有关,但仍需进一步研究。
综上所述,本研究发现沉默MRP4基因对LPS诱导的大鼠PMVECs的通透性增加及细胞骨架的破坏发挥保护效应,这为脓毒症急性肺损伤的临床防治提供了新的干预靶点。
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