2017, Vol. 26
脑组织结构复杂且具有特异性，特别是血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的存在使得许多药物难以进入脑组织发挥作用。确定一种药物能否治疗颅内感染，是否具有较好的BBB透过率是很重要的。2004年美国传染病学会(IDSA)脑膜炎治疗指南推荐[1]，万古霉素作为术后治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)颅内感染的抗菌药物，但其在BBB中透过率仅为18%左右[2]。因此，万古霉素在颅内能否达到有效治疗浓度是有争议的。而利奈唑胺作为新型抗菌药物，对MRSA等革兰阳性菌同样具有较强抗菌活性，而且在脑脊液中浓度较高，对利奈唑胺渗透进入革兰阳性菌感染及神经外科术后患者脑脊液的研究发现其BBB透过率达70%左右[3-4]。但这些研究多局限于体内研究，由于危重感染者病情的复杂性及术后BBB破坏等一些病理生理改变必然会影响药物在体内分布，因此，体内研究所得到药物透过BBB参数变异常常很大，而且目前对利奈唑胺治疗颅内感染多局限于个案报道，没有临床数据对万古霉素和利奈唑胺治疗颅内感染疗效比较。故建立良好的体外BBB模型以排除各种干扰因素，首先进行万古霉素和利奈唑胺体外BBB透过率比较，有益于为临床药物疗效评价提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂HUVEC，C6细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；RPMI1640培养基(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；福司可林(美仑生物)；Ro20-1724(Abcam)；液相相关试剂(甲醇，甲酸，乙腈，乙酸铵等) (Thermos Fisher Scientific)；利奈唑胺(辉瑞制药有限公司)，万古霉素(美国礼来公司)。
1.2 仪器细胞培养箱(Thermos)；MillicellR ERS-2(Millipore)；Agilent 1200型液相色谱系统(Agilent Technologies)；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(15 cm×0.4 cm，5 μm) (Agilent Technologies)；电子分析天平-AT-261型(Mettler)；台式高速离心机(Eppendorf)；pH计-pHs-25型(上海精科雷磁仪器厂)；超声机-HS10260D型(BENCHTOP)。
1.3 试剂配制两种药物标准储备液：准确称取一定含量的两种药物标准品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，得到1 mg/mL的标准储备液，置于4 ℃冰箱中保存。临用前用水配成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL系列浓度的标准溶液。
1.4 实验方法 1.4.1 细胞培养HUVEC，C6细胞培养于含10% FBS的RPMI1640完全培养基中，37℃，5% CO2饱和湿度下培养，0.25%胰酶消化，取对数生长期细胞用于实验。
1.4.2 体外BBB模型构建1×106个小鼠星形胶质瘤细胞(C6) 接种于12孔细胞板内，加入1.5 mL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，待C6细胞完全贴壁后，将1x105个HUVEC细胞接种于Inserts内，加入0.5 mL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，使胶质细胞可以通过微孔与内皮细胞系形成非接触式共培养作为模型实验组。每2~3 d换全液1次，培养3 d后，HUVEC细胞完全融合，给予福司可林和Ro20-1724各50 μd/L以增加内皮细胞的紧密连接的程度，培养5 d。
1.4.3 跨内皮阻抗(trans-endotheilal electrical resistance，TEER)测量采用MILLIPORE公司Millicell Electrical Resistance System(Millicell-ERS-2) 测量TEER值。测量前按说明对Millecell-ERS仪表和电极进行校正。测量时将电极短端进入到细胞插板里面培养液中(注意不要和细胞层接触)，长端浸入到细胞插板外面培养液中。以动态TEER峰值作为HUVEC细胞紧密连接形成的标准。
Ω测量=Ω实测-Ω空白。考虑面积影响因素，校正后公式：测量值(Ωcm2)=细胞单层值(Ω)×膜面积(cm2)
1.4.4 给药与采样成功建立BBB模型后，更换新鲜培养基，在供体池内分别按0.05 mg/mL加入2种药物各1 mL，于培养30 min、1、2、4 h后分别取一部分受体池培养液，-20℃冰箱保存。
1.4.5 样品前处理待细胞培养液样品自然解冻后，摇匀，准确吸取200 μL于2 mL离心管中，再加入600 μ L甲醇，充分涡旋30 s，12000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm针头滤膜，进行HPLC分析。
1.4.6 液相色谱检测条件(1) 万古霉素流动相为50 mnol/L NH4H2PO4(pH 4):乙腈(92: 8，v/v)；流速：1 mL/min；柱温：40℃；检测波长：220 nm(UV)；进样体积：20 μL；(2) 利奈唑胺流动相为乙腈:乙酸盐缓冲液(300 mnol/L，pH 3.5)：水(18: 10: 72，v/v/v)；流速1 mL/min；柱温25℃；检测波长250nm(UV)；进样体积20 μL。
1.4.7 标准曲线绘制准确吸取空白培养液180 μL于2 mL离心管中，向空杯培养液中分别添加0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL系列浓度药物20 μL，使空白加标浓度为0.005、0.01、0.02、0.04、0.06 mg/mL，涡旋混匀1 min，第1管中加入20 μL空白培养液为空白对照，按1.4.5样品前处理方法进行处理，按1.4.6进行液相色谱检测。以药物峰面积(X)对其浓度(Y)做线性回归，求得回归方程和相关系数(r2)。
2 结果 2.1 HUVEC和C6共培养可成功构建体外BBB模型HUVEC和C6体外共培养3 d内，细胞间TEER维持在182~200 Ω，给予福司可林和Ro20-1724培养5 d后，细胞间TEER可达到227.4 Ω，表明HUVEC和C6共培养可成功构建体外BBB模型，满足后续实验需要，见图 1。
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| 图 1 明亮视野下C6, HUVEC细胞状态图×100 |
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万古霉素液相色谱检测结果如图 2~4所示，万古霉素药峰与培养液中其他成分分开，干扰少，色谱保留时间为4.648 min。不同批次间保留时间会有细微差异，但总体比较稳定。
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| 图 2 万古霉素空白色谱图 |
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| 图 3 万古霉素纯标(0.04 mg/mL)色谱图 |
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| 图 4 万古霉素实际样品(4 h)色谱图 |
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利奈唑胺液相色谱检测结果如图 5~7所示，利奈唑胺药峰与培养液中其他成分分开，干扰少，色谱保留时间为11.648 min。不同批次间保留时间会有细微差异，但总体比较稳定。
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| 图 5 利奈唑腔空白色谱图 |
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| 图 6 利奈唑腔纯标(0.04 mg/mL)色谱图 |
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| 图 7 利奈唑腔实际样品(4 h)色谱图 |
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两种药物的标准曲线与线性范围见表 1。在0.005~0.6 mg/mL的范围内线性良好，满足实验要求。
| 药物 | 线性范围 (mg/mL) | 回归方程 | 相关系数 (r2) |
| 万古霉素 | 0.005~0.6 | 6×10-5 0.000 5 | 0.998 8 |
| 利奈唑胺 | 0.005~0.6 | 10-4 0.001 8 | 0.998 0 |
两种药物在不同时间点浓度见表 2。
| 药物 | 30 min | 1 h | 2 h | 4 h |
| 万古霉素 | 0.001 5 | 0.002 6 | 0.003 9 | 0.004 8 |
| 利奈唑胺 | 0.003 0 | 0.004 7 | 0.007 5 | 0.010 4 |
体外BBB模型中，两种药物透过率见表 3。
颅内感染患者由于BBB的存在，一般抗菌药物难以穿透BBB在脑脊液中达到有效抗菌浓度。一直以来，万古霉素被认为是治疗MRSA的首选药，在MRSA导致的颅内感染中，仍以万古霉素为主。但其高相对分子质量、强亲水特性使其理论上难以完全有效透过正常BBB，目前应用万古霉素主要基于颅内感染时BBB通透性增加使其渗透入脑脊液浓度增高。另外由于万古霉素的广泛应用，MRSA对其敏感性显著降低[5]，耐万古霉素肠球菌(VRE)也逐年增加，使得万古霉素治疗效果大大降低。而利奈唑胺是一种新型恶唑烷酮类抗菌药，其组织分布广泛，耐药率低，在治疗MRSA、VRE等多重耐药革兰阳性菌引起的感染时已显示出明显优势。理论上其可成为治疗MRSA等革兰阳性菌所致颅内感染的重要药物。但自利奈唑胺获得FDA批准上市后，颅内感染并非其产品适应证。因为目前尚缺乏利奈唑胺治疗颅内感染的随机对照研究。这就需要首先对利奈唑胺的BBB透过率进行系统评估。尽管已有少量文献采用利奈唑胺替代治疗初始万古霉素治疗失败的颅内感染患者成功案例报道，同时跟踪监测利奈唑胺血浆、脑脊液浓度[6-7]。但这些研究多为个案报道，局限于体内研究，尽管利奈唑胺显示了较高的BBB透过率，但并未监测万古霉素血浆、脑脊液浓度，缺乏与万古霉素BBB透过率对比来评价其优劣性。同时体内试验所获得利奈唑胺脑脊液浓度往往个体差异较大，Yogev等[8]认为，尽管颅内感染炎性程度并不影响利奈唑胺BBB透过率，但不同感染患者脑积水程度不同引起的脑脊液容积差异是导致药物脑脊液浓度变异性增大主要原因。因此，建立良好的体外BBB模型就可以很好地模拟体内情况，避免体内研究的多重复杂干扰因素，在相同试验条件下，进行万古霉素和利奈唑胺BBB透过率的对比，为进一步随机试验研究评估万古霉素、利奈唑胺治疗颅内感染有效性提供理论基础。
本试验首先参考Hurst等[9]方法稍加改良，选择人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和小鼠星形胶质细胞(C6) 通过非接触式共培养构建体外BBB细胞模型。这样的模型在形态和结构上与体内BBB非常接近。然后通过跨内皮阻抗(TEER值)测定对该模型进行功能评价。TEER值监测的是小离子通透物理屏障的电阻抗，能反映细胞的完整性和通透性，被公认为是测定BBB完整性最精确和敏感的指标[10]。试验表明，HUVEC在C6胶质细胞的作用下，细胞间TEER维持在182~200，给予福司可林和Ro20-1724培养5 d后，产生了达227.4 Ω的TEER值，类似于脑微血管内皮细胞/星形胶质细胞共培养模型(≥200 Ω)[11-12]。说明建立的体外BBB细胞模型在限制通透性功能方面也保留了体内BBB特性。而高效液相色谱法(HPLC)作为目前临床上用于药物浓度监测最常用的方法，具有方法简便、分离效果好、分辨率及灵敏度高等特点。本试验中，所得两种药物峰形好，药峰与培养液中其他成分分开，干扰少，万古霉素出峰时间在4.5 min左右，而利奈唑胺出峰时间在11.5 min左右。两者经HPLC测定，在0.005~0.6 mg/mL的范围内线性良好，满足实验要求。
通过本试验发现利奈唑胺出峰时间明显晚于万古霉素，表明利奈唑胺相对分子质量小于万古霉素。不同时间点(30 min，1 h，2 h，4 h)培养液中药物浓度也较万古霉素明显升高，给药后4 h利奈唑胺体外BBB透过率约为万古霉素的两倍，说明利奈唑胺相比万古霉素更容易渗透入脑脊液。尽管目前利奈唑胺用于颅内感染治疗仍属于非常规治疗，但国内外仍有利奈唑胺成功治疗颅内感染的病例报道。Frasca和Schuster[13]报道了1例VRE引起的颅内感染患者，在应用其他药物无效后改用利奈唑胺治疗后患者颅内感染症状迅速好转。Watanabe等[14]报道了1例MRSA引起的颅内感染新生儿患者，在使用万古霉素效果不明显后，改用利奈唑胺后患者病情明显好转。因此，Peppard等[15]提出对MRSA引起的颅内感染，若万古霉素疗效欠佳，可用利奈唑胺。2011年美国IDSA指南也推荐对MRSA引起的颅内感染可选用万古霉素或利奈唑胺(推荐级别B-Ⅱ级)[16]。同时利奈唑胺作用位点和方式独特，不易与其他抗菌药物发生交叉耐药性。
最后，通过对利奈唑胺和万古霉素体外BBB透过试验对比显示，利奈唑胺体外BBB透过率明显高于万古霉素，在用于颅内感染患者中，特别为严重的VRE和万古霉素敏感率较低的MRSA感染患者，提供了一种治疗选择。但本试验尚处于本课题研究初级阶段，下一步拟通过构建脑膜炎兔模型，对比利奈唑胺、万古霉素在BBB通透性增加的兔模型血、脑脊液中药代动力学，得出最佳给药方案，为临床治疗颅内感染提供依据。
| [1] | Tonkel AR, Hartman BJ, Kaplan SL, et a1. Practice guidelines for the management of bacterial meningitis[J]. Clin Infect Dis, 2004, 39(9): 1267-1284. DOI:10.1086/425368 |
| [2] | Albanese J, Leone M, Bruguerolle B, et al. Cerebrospinal Fluid Penetration and Pharmacokinetics of Vancomycin Administered by Continuous Infusion to Mechanically Ventilated Patients in an Intensive Care Unit[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000, 44(5): 1356-1358. DOI:10.1128/AAC.44.5.1356-1358.2000 |
| [3] | Alasdair P. Pharmacokinetic and pharmacodynamic profile of linezolid in healthy volunteers and patients with Gram-positive infections[J]. J Antimicrob Chemoth, 2003, 51(2): 17-25. DOI:10.1093/jac/dkg248 |
| [4] | Tsona A, Metallidis S, Foroglou N. Linezolid penetration into cerebrospinal fluid and brain tissue[J]. J Chemother, 2010, 22(1): 17-19. DOI:10.1179/joc.2010.22.1.17 |
| [5] | 张烁, 熊辉, 汪波. 万古霉素谷浓度水平与临床疗效的关系[J]. 中华急诊医学杂志, 2016, 25(6): 757-763. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2016.06.015 |
| [6] | Maranich AM, Rajnik M. Successful treatment of vancomycin-resistant enterococcal ventriculitis in a pediatric patient with linezolid[J]. Mil Med, 2008, 173(9): 927-929. DOI:10.7205/MILMED.173.9.927 |
| [7] | Milstone AM, Dick J, Carson B, et al. Cerebrospinal fluid penetration and bacteriostatic activity of linezolid against Enterococcus faecalis in a child with a ventriculoperitoneal shunt infection[J[J]. Pediatr Neurosurg, 2007, 43(5): 406-409. DOI:10.1159/000106392 |
| [8] | Yogev R, Damle B, Levy G, et al. Pharmacokintics and distribution of linezolid in cerebrospinal fluid in children and adolescepts[J]. Pediatr Infect Dis J, 2010, 29(9): 827-830. DOI:10.1097/INF.0b013e3181df4b9a |
| [9] | Hurst RD, Fritz IB. Properties of an immortalised vascular endothelial/glioma cell co-culture model of the blood-brajn barrier[J]. J Cell Physiol, 1996, 167(1): 8l-88. DOI:10.1002/(SICI)1097-4652(199604)167:1<81::AID-JCP9>3.0.CO;2-8 |
| [10] | Gaillard PJ, Voorwinden LH, Nielsen JL, et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes[J]. Eur J Pharm Sci, 2001, 12(3): 215-222. DOI:10.1016/S0928-0987(00)00123-8 |
| [11] | Li B, Zhao WD, Tan ZM, et al. Involvement of Rho/ROCK signalling in small cell lung cancer migration through human brain microvascular endothelial cells[J]. FEBS Lett, 2006, 580(17): 4252-4260. DOI:10.1016/j.febslet.2006.06.056 |
| [12] | Li M, Shang DS, Zhao WD, et al. Amyloid beta interaction with receptor for advanced glycation end products up—regu—lates brain endothelial CCR5 expression and promotes T cells crossing the blood-brain barrier[J]. J Immunol, 2009, 182(9): 5778-5788. DOI:10.4049/jimmunol.0803013 |
| [13] | Frasca KL, Schuster MG. Vancomycin-resistant enterococcal meningitis in an autologous stem cell transplant recipient cured with linezolid[J]. Transpl Infect Dis, 2013, 15(1): 1-4. DOI:10.1111/tid.12032 |
| [14] | Watanabe S, Tanaka A, Ono T, et al. Treatment with linezolid in a neonate with meningitis caused by methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis[J]. Eur J Pediatr, 2013, 172(10): 1419-1421. DOI:10.1007/s00431-013-1978-7 |
| [15] | Peppard WJ, Johnston CJ, Urmanski AM. Pharmacologic options for CNS infections caused by resistant Gram—positive organisms[J]. Expert Rev Anti Infect ther, 2008, 6(1): 83-99. DOI:10.1586/14787210.6.1.83 |
| [16] | Liu C, Bayer A, Cosgrove SE, et a1. Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of america for the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in adults and children; executive summary[J]. Clin Infect Dis, 2011, 52(3): 285-292. DOI:10.1093/cid/cir034 |